真核細(xì)胞通過(guò)選擇性自噬,特異性地清除受損的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的蛋白聚集體或入侵的病原體等自噬底物,從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。與非選擇性自噬不同,選擇性自噬通過(guò)底物受體蛋白確保特定底物的識(shí)別、隔離和包裹,以便于隨后的溶酶體降解。然而,選擇性自噬過(guò)程中自噬體形成的時(shí)空調(diào)控機(jī)制尚不清晰�；谖覀兦捌诘难芯拷Y(jié)果,我們提出科學(xué)假設(shè):Rab GTPase蛋白通過(guò)與底物受體蛋白的相互作用,調(diào)控選擇性自噬的起始以及自噬體的靶向性發(fā)生。Rab GTPase蛋白廣泛分布于細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中,在囊泡運(yùn)輸和融合等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。我們發(fā)現(xiàn)人類(lèi)的Rab GTPase蛋白家族普遍存在自噬性降解,這種現(xiàn)象類(lèi)似于II型LC3和底物受體蛋白的降解。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),能夠被自噬性降解的Rab GTPase蛋白與受體蛋白存在相互作用。我們以線粒體自噬作為驗(yàn)證模型,發(fā)現(xiàn)16個(gè)Rab GTPase蛋白被招募到去極化的線粒體上,我們還發(fā)現(xiàn)這些Rab GTPase的內(nèi)源性蛋白在線粒體自噬誘導(dǎo)條件下發(fā)生自噬性降解。更重要的是,過(guò)表達(dá)Rab GTPase蛋白能夠促進(jìn)線粒體自噬的發(fā)生,而Rab GTPase蛋白的缺失則會(huì)抑制線粒體自噬。機(jī)制... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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自噬性GFP酶解實(shí)驗(yàn)

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文引言31.1）。圖1.1篩選過(guò)程示意圖。為了便于理解整個(gè)篩選過(guò)程，以下通過(guò)舉例簡(jiǎn)要闡述篩選原理。自噬性GFP酶解實(shí)驗(yàn)由于GFP在溶酶體中的穩(wěn)定性相對(duì)較高，因此帶有GFP標(biāo)簽的蛋白進(jìn)入溶酶體后會(huì)產(chǎn)生游離的GFP，后者可以利用western-blot檢測(cè)到。在誘導(dǎo)自噬后，處理組游離GFP水平若顯著高于對(duì)照組，則該蛋白存在自噬性降解的可能。如圖1.2所示，Rab1、Rab2、Rab3、Rab4和Rab5在25kDa處存在明顯的GFP片段條帶且處理組顯著高于對(duì)照組，而RabL4則無(wú)此現(xiàn)象，因此我們排除了RabL4。通過(guò)這一輪篩選，我們發(fā)現(xiàn)44個(gè)Rabs中有31個(gè)存在GFP酶解現(xiàn)象。圖1.2自噬性GFP酶解實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建GFP-Rabs表達(dá)質(zhì)粒，在HEK293T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)GFP-Rabs蛋白，24h后對(duì)照組使用DMSO處理2h，處理組使用Torin1（50nM）處理2h。自噬阻斷時(shí)GFP酶解實(shí)驗(yàn)

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文引言4在自噬過(guò)程中，Atg7作為一種與泛素激活酶E1具有同源性的自噬相關(guān)蛋白，對(duì)于自噬體的形成極為關(guān)鍵，當(dāng)細(xì)胞缺乏Atg7時(shí)，一般認(rèn)為細(xì)胞自噬被完全阻斷。當(dāng)自噬被阻斷后，GFP-Rabs若無(wú)法被有效酶解，則進(jìn)一步說(shuō)明其存在自噬性降解。因此我們使用Atg7-/-HEK293細(xì)胞重復(fù)了上述自噬性GFP酶解實(shí)驗(yàn)。如圖1.3所示，當(dāng)自噬被阻斷，Rab1、Rab2、Rab3、Rab14和Rab18無(wú)法形成明顯的GFP片段條帶，而Rab17可以，因此我們排除了Rab17。通過(guò)這一輪篩選，我們發(fā)現(xiàn)28個(gè)RabGTPase蛋白在Atg7缺失時(shí)無(wú)法被有效酶解。圖1.3自噬阻斷時(shí)GFP酶解實(shí)驗(yàn)。使用GFP-Rabs表達(dá)質(zhì)粒，在Atg7-/-HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)GFP-Rabs蛋白，24h后對(duì)照組使用DMSO處理2h，處理組使用Torin1（50nM）處理2h。自噬誘導(dǎo)后mCherry-GFP-Rab熒光檢測(cè)相較于mCherry，GFP的熒光信號(hào)在溶酶體的酸性環(huán)境中更容易淬滅，因此通過(guò)構(gòu)建mCherry-GFP-Rabs質(zhì)粒在U2OS細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)蛋白，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。若GFP和mCherry的熒光信號(hào)出現(xiàn)重疊（黃色），則代表該蛋白不在溶酶體相關(guān)囊泡內(nèi)；而如果出現(xiàn)單獨(dú)的mCherry熒光信號(hào)（紅色），則代表該蛋白在溶酶體相關(guān)囊泡內(nèi)（DanielJ.Klionskyetal.,2007）。如圖1.4所示，圖中Rab6、Rab8


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