谷氨酸棒桿菌是生產氨基酸、有機酸等的重要菌株,廣泛應用于食品、醫(yī)藥領域。利用基因編輯技術對谷氨酸棒桿菌進行基因功能研究,在提高目的產物產量、發(fā)現(xiàn)新的基因功能等方面有重要意義。近年來,基因編輯技術發(fā)展日新月異,從基于同源重組的傳統(tǒng)基因編輯技術到以人工核酸酶介導的基因編輯均在谷氨酸棒桿菌中得到合理應用。其中,CRISPR技術以其快速、簡便、編輯效率高等優(yōu)點成為現(xiàn)階段研究者用于改造谷氨酸棒桿菌的主要技術,但是更為簡單、高效的編輯手段依舊需要進一步研究開發(fā),以獲得優(yōu)良菌株應用于工業(yè)生產中。 

【文章來源】：生物工程學報. 2020,36(05)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

CRISPR/Cas9介導的基因編輯[49]

自殺質粒，也稱非復制型質粒，其攜帶的復制元件可以在大腸桿菌中正常作用，但在待改造菌株中無法正常發(fā)揮其功能[16]。自殺質粒介導的同源重組又分為一次交換重組和雙交換重組兩種方式。一次交換重組主要是通過引入抗性標記的方法使外源基因插入宿主菌的基因組中，從而使目的基因失活。但是，抗性基因的引入可能造成極性效應，影響菌體的生長或其他功能性基因的表達。為了克服這一缺陷，雙交換重組得到了應用，即在一次交換重組的基礎上再進行一次等位替換，丟掉基因編輯過程中不需要的外源部分(圖1[17])。在谷氨酸棒狀桿菌中，依賴于雙交換重組的基因敲除系統(tǒng)主要是通過含有反向篩選標記的自殺性質粒來實現(xiàn)的，其中最常用的反向篩選標記為蔗糖致死基因sacB基因。早在1994年，Sch?fer等[18]便將源于大腸桿菌的pK系列質粒如pK18、pK19與RP4質粒的轉移機制相結合，再將來源于枯草芽孢桿菌的sacB基因擴增到具有轉移性質的pK系列質粒中，基于同源重組的原理對谷氨酸棒狀桿菌的基因組進行改造，敲除了其基因組上的thrB基因。在此基礎上，Tan等[17]對sacB基因的啟動子進行了更換、篩選，其中包括啟動子PsacB、Pneo、PlacM以及PF104，實驗結果顯示啟動子PlacM在谷氨酸棒狀桿菌中的使用效果最好。隨著研究的深入，一些新的反向篩選標記也逐漸被開發(fā)利用。2011年，Kim等[19]將鏈霉素抗性基因rpsL作為谷氨酸棒桿菌基因編輯過程的反向篩選標記，提高了谷氨酸棒桿菌的編輯效率；2014年，Ma等[20]開發(fā)了upp基因作為反向篩選標記，并結合Ⅰ-SceⅠ介導的重組系統(tǒng)，實現(xiàn)了突變體的高效篩選。此外，與自殺質粒具有相同作用的條件復制型質粒也經常出現(xiàn)在谷氨酸棒桿菌的基因編輯過程中。目前在谷氨酸棒狀桿菌中有報道的主要是溫度敏感型質粒，其在不同溫度條件下，質�？截悢�(shù)不同[21]。在谷氨酸棒狀桿菌的基因敲除過程中，經常使用含有溫敏型復制子的質粒有pBS5T[22]和pSFKT2[23]。Chinen等[22]利用質粒pBS5T對谷氨酸棒狀桿菌的pfk基因和aceE基因進行了敲除。隨著基因工程的發(fā)展，已經有研究嘗試含有將sacB負篩選標記的自殺質粒與溫度敏感型復制子相結合，來提高谷氨酸棒狀桿菌基因敲除過程的篩選效率[23]。1.2 Cre/loxP介導的位點特異性重組

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3573382