隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和需求的多樣化,用于核酸檢測(cè)的各種PCR衍生技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。數(shù)字PCR是一種單分子水平的大規(guī)模分區(qū)擴(kuò)增定量核酸檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)以微腔室/微孔或微滴作為PCR反應(yīng)器,無需校準(zhǔn)物和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品初始濃度的絕對(duì)定量,具有高靈敏度、高特異性和高精確度的特點(diǎn)。本文詳細(xì)介紹了數(shù)字PCR的技術(shù)發(fā)展史、作用原理以及儀器平臺(tái)類型,系統(tǒng)闡述了數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)、疾病診斷、環(huán)境及食品監(jiān)管等方面的應(yīng)用概況,并對(duì)該技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望,以期對(duì)未來數(shù)字PCR的開發(fā)利用提供參考。 

【文章來源】：遺傳. 2020,42(04)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

數(shù)字PCR的作用原理

生物技術(shù)的迅猛發(fā)展促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因作物的誕生。在轉(zhuǎn)基因植物研究中，為確保轉(zhuǎn)基因植物的穩(wěn)定整合和遺傳，通常會(huì)選擇單拷貝的純合轉(zhuǎn)基因植株作為進(jìn)一步研究的對(duì)象，而且純合子個(gè)體的檢測(cè)和隨后的選擇是促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移到大田的關(guān)鍵。此外，在轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)入市場(chǎng)前，各個(gè)國家、組織和地區(qū)都制定了明確的政策和法規(guī)進(jìn)行監(jiān)管，轉(zhuǎn)基因作物中插入的外源基因拷貝數(shù)是生物安全評(píng)價(jià)中一項(xiàng)重要內(nèi)容[23]。因此，在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)時(shí)會(huì)根據(jù)需求不同測(cè)定其拷貝數(shù)與合子性。先前的研究一般采用Southern blot[24,25]、qPCR[26～28]和NGS[29]等方法進(jìn)行檢測(cè)。但以上檢測(cè)方法均存在一定程度的缺陷。Southern blot可確定被檢轉(zhuǎn)基因植株的拷貝數(shù)，也可根據(jù)雜交信號(hào)亮度差異區(qū)分雜合與純合植株，但模板需求量大而且對(duì)DNA質(zhì)量要求較高，耗時(shí)繁瑣而且若采用同位素標(biāo)記探針還會(huì)有輻射影響[30]。采用qPCR對(duì)于轉(zhuǎn)基因植株的合子性進(jìn)行檢測(cè)，不同的實(shí)驗(yàn)室獲得結(jié)果存在爭議：或主張?jiān)摲椒o法區(qū)分純合子與雜合子；或可通過精確的擴(kuò)增條件進(jìn)行有效區(qū)分雜合子[26]。若以qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株的拷貝數(shù)，對(duì)于基因組較大的轉(zhuǎn)基因植株則無法區(qū)分一個(gè)或兩個(gè)拷貝，需達(dá)到2倍以上的差異[31]。dPCR在轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)及其雜合子鑒定方面具有模板用量少、節(jié)省時(shí)間及勞動(dòng)量和結(jié)果更為精準(zhǔn)的優(yōu)勢(shì)。在玉米(Zea mays L.)中，采用qPCR和ddPCR兩種方法均可成功檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因玉米雜合子，但ddPCR因其可直接絕對(duì)定量而更為便捷[32]。目前已建立了適用于水稻(Oryza.sativa L.)、柑橘(Citrus sinensis L.)、馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)、玉米(Zea mays L.)、番茄(Solanum lycopersicum L.)和小麥(Triticum aestivum L.)6種轉(zhuǎn)基因作物外源基因拷貝數(shù)的ddPCR檢測(cè)體系[33]。3.1.2 dPCR對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分的檢測(cè)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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