發(fā)布時間：2021-12-25 03:05

　　CRISPR-Cas是一種原核生物的抵御外源遺傳物質(zhì)（如質(zhì)粒和病毒等）的獲得性免疫系統(tǒng)。嗜熱古菌冰島硫化葉菌（Sulfolobus islandicus）REY15A編碼一個I-A亞型和兩個III-B（Cmr-α和Cmr-β）亞型的CRISPR-Cas系統(tǒng)。該菌編碼的Csa3家族蛋白（Csa3a和Csa3b）是目前古菌中已知的唯一與CRISPR-Cas系統(tǒng)關(guān)聯(lián)的調(diào)控因子。功能研究表明,Csa3a激活CRISPR免疫適應,Csa3b為I-A型干涉復合物的抑制因子。本研究聚焦由Csa3a和Csa3b組成的調(diào)控CRISPR免疫適應的整合途徑和由Csa3b參與的III-B亞型CRISPR系統(tǒng)RNA干涉的調(diào)控機制。本研究表明,過表達csa3b嚴重阻礙了S.islandicus細胞的生長,比較轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)csa3b過表達上調(diào)III-B系統(tǒng)的cmr等基因。通過DNase I Footprinting和等離子體共振等實驗證實Csa3b蛋白特異性結(jié)合免疫適應cas操縱子的啟動子以及III-B亞型Cmr-α和Cmr-β操縱子的啟動子。與野生型菌株相比,csa3b基因缺失菌株能從穿梭質(zhì)粒p Se SD中獲取新... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：109 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

CRISPR-Cas系統(tǒng)基因簇結(jié)構(gòu)(Gongetal.,2019)

硫化葉菌Csa3家族蛋白調(diào)控CRISPR免疫適應和干涉機制的研究32019年，Makarova等人綜合標志基因的鑒定、序列的相似性聚類和保守基因的系統(tǒng)發(fā)育分析等方面篩選了基因組和宏基因組數(shù)據(jù)庫，將CRISPR系統(tǒng)的分類進行了更新，分成了2類，6種類型和33個亞型(Makarovaetal2019)（圖1-2）。CRISPR系統(tǒng)分類增加的一個關(guān)鍵原因是在基因工程工具開發(fā)的驅(qū)動下，驗證出多個新的2類系統(tǒng)，與2015年的2型4個亞型相比，新的2類系統(tǒng)包括3型17個亞型，并且新鑒定的V型系統(tǒng)由轉(zhuǎn)座子編碼的TnpB核酸酶進化而來，產(chǎn)生了大量的V型變體，其中許多在將來可能成為獨立的亞型(KooninandMakarova2017,Faureetal2019c)。第二個關(guān)鍵原因是發(fā)現(xiàn)了一些CRISPR系統(tǒng)的衍生物，這些類型目前未發(fā)現(xiàn)定向的切割活性，因此可能具有不同于適應性免疫的功能，包括IV型、I型的多個變體和至少一個V型變體，這些通常編碼在可移動遺傳元素中。最近的實驗也表明類似Tn7的轉(zhuǎn)座子編碼的衍生CRISPR-Cas變體參與crRNA依賴的DNA轉(zhuǎn)座(Klompeetal2019,Streckeretal2019)。第三個原因是發(fā)現(xiàn)了許多輔助CRISPR的基因家族（特別是III型系統(tǒng)中），這些基因通常涉及信號轉(zhuǎn)導和調(diào)控作用(Shmakovetal2018,Shahetal2019)。圖1-2CRISPR系統(tǒng)的兩大類和組織模塊（Makarovaetal.,2019)Fig.1-2ThetwoclassesofCRISPR–cassystemsandtheirmodularorganization

華中農(nóng)業(yè)大學2020屆博士研究生學位論文41.2.2CRISPR-Cas系統(tǒng)的分布對13116個細菌和古細菌的完整基因組分析表明CRISPR-Cas系統(tǒng)在細菌門和古細菌門中分布不均勻。324個古菌基因組中276個(85.2%)有CRISPR-Cas系統(tǒng)，表明絕大部分古菌中都有這種免疫系統(tǒng)，并且在嗜熱古菌中比例更高，92個嗜熱古菌基因組中有89個(96.7%)能編碼CRISPR-Cas，但在12792個細菌基因組中的檢測到5412個(42.3%)，遠低于古菌門中的比例(Makarovaetal2019)。在大多數(shù)細菌和古菌中，一類的CRISPR-Cas系統(tǒng)遠遠多于二類。同時一類的III型系統(tǒng)在泉古菌中十分富集(Garrettetal2011,Charpentieretal2015)，而二類CRISPR-Cas系統(tǒng)似乎是細菌獨有的，二類系統(tǒng)在古菌中缺失可能與RNaseIII的缺失相關(guān)(ChyouandBrown2019,Faureetal2019b)。特別的是，Tenericutes細菌中只檢測二類系統(tǒng)的存在，還有一些主要由共生微生物組成的細菌群體，如Chlamydia或最近發(fā)現(xiàn)的潛在門類（CandidatePhylaRadiation，CPR），幾乎沒有CRISPR-Cas系統(tǒng)。另外，大多數(shù)VI型系統(tǒng)，特別是最豐富的VI-B亞型基本只在擬桿菌門和梭桿菌門的細菌基因組中得到鑒定(Bursteinetal2016,Dudeketal2017,Castelleetal2018)（圖1-3）。圖1-3主要古菌和細菌門中CRISPR-Cas系統(tǒng)的分布（Makarovaetal.,2019）Fig.1-3DistributionofCRISPR-Cassysteminthemajorarchaealandbacterialphyla.


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