羽扇豆醇（lupeol）是一種常見的五環(huán)三萜類化合物,是植物特有的次級代謝產(chǎn)物,廣泛存在于水果、蔬菜和中草藥中。羽扇豆醇具有抗氧化、抗惡性腫瘤增殖、抗炎癥、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和降低膽固醇等多種藥理活性,被廣泛應(yīng)用于腫瘤的預(yù)防和治療。但是大部分五環(huán)三萜類化合物天然產(chǎn)量極低,且大多是從植物中直接提取,對植物資源有很高的依賴性和破壞性。依靠化學(xué)合成則面臨成本高、副產(chǎn)物多、毒性大等限制。使用生物技術(shù)手段既可以提高其產(chǎn)量,又可以降低成本,是工業(yè)化生產(chǎn)生物活性物質(zhì)的重要方向。羽扇豆醇合酶（lupeol synthase,LUP）是羽扇豆醇合成過程中的關(guān)鍵酶,有報道嘗試改造該酶以構(gòu)建產(chǎn)羽扇豆醇的工程菌,但轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量均較低。前期研究發(fā)現(xiàn)擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組中雖然存在羽扇豆醇合酶基因,但該基因的表達(dá)量很低,在擬南芥植株中也不能檢測到羽扇豆醇。因此,能否通過提高羽扇豆醇合酶基因的表達(dá)量,在植物細(xì)胞中促進(jìn)羽扇豆醇的生物合成?為了回答這個問題,本研究利用基因工程手段,克隆擬南芥AtLUP1基因,構(gòu)建AtLUP1超量表達(dá)體系,并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,獲得擬南芥超量表達(dá)植株,檢測超量表達(dá)植... 

【文章來源】：中南林業(yè)科技大學(xué)湖南省

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

羽扇豆醇合成途徑

以擬南芥葉片ｃＤＮＡ為模板，使用表１全長引物ＡｔＬＵＰｌ－Ｆｗ／ＡｔＬＵＰｌ－Ｒｓ，??進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)無法擴(kuò)增出目標(biāo)片段，證明該基因在擬南芥中不表達(dá)或表??達(dá)量極低。使用ｇＤＮＡ為模板進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，得到一條約５?ｋｂ的序列（圖２．２－ａ）。??將此片段切膠回收，回收片段與ＰＭＤ１８－Ｔ?ｖｅｃｔｏｒ連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Ｔｒａｎｓ５ａ感??受態(tài)細(xì)胞中，利用添加了?Ａｍｐ的ＬＢ固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆，挑單菌落進(jìn)行??菌液ＰＣＲ擴(kuò)增，ＰＣＲ產(chǎn)物用１．０％瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖２．２－ｂ），將成功檢??測的菌液送測序。經(jīng)過測序，得到一段長為４３０２?ｂｐ的核苷酸序列，將測序結(jié)果??序列與擬南芥基因在ＮＣＢＩ上進(jìn)行ＢＬＡＳＴ比對，比對結(jié)果表明此序列??與核苷酸序列相同，表明成功克隆目標(biāo)基因。??２４??

ｂ）?ｇＤＮＡ樣品質(zhì)量電泳檢測；泳道Ｍ，?ＤＮＡ分子量標(biāo)記Ｔｍｎｓ５Ｋ；泳道１，擬南芥葉片??ＤＮＡ〇??圖２．１擬南芥核酸提取質(zhì)量檢測??Ｆｉｇ．?２．１?Ｑｕａｌｉｔｙ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｎｕｃｌｅｉｃ?ａｃｉｄ?ｉｎ?Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ??２．３．２胤基因的克隆??以擬南芥葉片ｃＤＮＡ為模板，使用表１全長引物ＡｔＬＵＰｌ－Ｆｗ／ＡｔＬＵＰｌ－Ｒｓ，??進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)無法擴(kuò)增出目標(biāo)片段，證明該基因在擬南芥中不表達(dá)或表??達(dá)量極低。使用ｇＤＮＡ為模板進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，得到一條約５?ｋｂ的序列（圖２．２－ａ）。??將此片段切膠回收，回收片段與ＰＭＤ１８－Ｔ?ｖｅｃｔｏｒ連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Ｔｒａｎｓ５ａ感??受態(tài)細(xì)胞中，利用添加了?Ａｍｐ的ＬＢ固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆，挑單菌落進(jìn)行??菌液ＰＣＲ擴(kuò)增，ＰＣＲ產(chǎn)物用１．０％瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖２．２－ｂ），將成功檢??測的菌液送測序。經(jīng)過測序，得到一段長為４３０２?ｂｐ的核苷酸序列，將測序結(jié)果??序列與擬南芥基因在ＮＣＢＩ上進(jìn)行ＢＬＡＳＴ比對

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CaMV35S啟動子及其在轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用和檢測[J]. 湯婷,謝實龍,祝旋,徐俊鋒,唐俊,汪小福.  浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2019(01)
[2]海洋沉積物來源哈茨木霉R5-1萜類化合物的分離鑒定與抗弧菌活性研究[J]. 馬新玥,趙業(yè),梁小蕊,季乃云.  煙臺大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)與工程版). 2019(01)
[3]合成生物學(xué)——生物工程產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的新時期[J]. 趙國屏.  生物產(chǎn)業(yè)技術(shù). 2019(01)
[4]氣相色譜法檢測工業(yè)用乙二醇純度及雜質(zhì)[J]. 范晨亮,張育紅,王川,彭振磊,高枝榮.  色譜. 2019(01)
[5]半枝蓮轉(zhuǎn)錄組高通量測序及黃酮類相關(guān)基因解析[J]. 鄒毅輝,劉昌勇,林澤燕,李珍.  福建農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2018(12)
[6]甘草中甘草酸的含量測定方法研究[J]. 徐建,康慧芬,楊惠琳,張立忠.  山東化工. 2018(21)
[7]芍藥PlFLS基因生物信息學(xué)分析及對擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化[J]. 史旻,孫靜,陶俊.  華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2018(05)
[8]薺菜雌蕊調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子SPT基因的克隆與擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化[J]. 張莉芳,楊正修,張學(xué)文,龍炎杏,趙燕.  作物研究. 2018(03)
[9]細(xì)葉杜香葉中三萜類化學(xué)成分研究[J]. 張擴(kuò),趙明,王美嬌,王丹,王金蘭,張樹軍.  中草藥. 2018(06)
[10]玉米ZmMGT12基因的表達(dá)分析及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化[J]. 李洪有,張素芝,陳慶富.  分子植物育種. 2018(18)

博士論文
[1]丹參酮合成關(guān)鍵基因SmCPS1與SmKSL1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究[D]. 白朕卿.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2018
[2]鵝掌柴三萜類成分及其主要藥效學(xué)研究[D]. 王國權(quán).華僑大學(xué) 2018
[3]重要三萜化合物關(guān)鍵合成基因的挖掘及其生物合成[D]. 喬瑋博.中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院武漢植物園) 2018
[4]白菜花粉發(fā)育相關(guān)基因BcMF3和BcMF4的轉(zhuǎn)基因功能驗證[D]. 劉樂承.浙江大學(xué) 2006

碩士論文
[1]脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BraLTP2在甘藍(lán)型油菜中超量表達(dá)導(dǎo)致表皮毛密度的增加和次級代謝物含量的改變[D]. 田妮妮.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2018
[2]褐蓋韌革菌、睡菜和枳的化學(xué)成分及生物活性研究[D]. 祝嬌嬌.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 2018
[3]珙桐DiMYB1基因的克隆、鑒定及功能研究[D]. 戴鵬輝.中南林業(yè)科技大學(xué) 2017
[4]枇杷葉中熊果酸的提取及分離的研究[D]. 王杰.北京林業(yè)大學(xué) 2016
[5]藥用三萜酸細(xì)胞工廠的構(gòu)建[D]. 王冬.天津科技大學(xué) 2015
[6]茶樹兩個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及功能驗證[D]. 貢年娣.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[7]超量表達(dá)SbMATE、CjMDH和CjDTC基因?qū)γ藁ㄖ杏袡C(jī)酸含量的影響[D]. 戴蔚華.西南大學(xué) 2014
[8]棗樹Zj2-CP基因植物表達(dá)載體構(gòu)建與功能驗證[D]. 郭慧娜.山西大學(xué) 2013
[9]青蒿素生物合成相關(guān)基因組織表達(dá)譜分析及超量表達(dá)ADS基因提高青蒿素含量的研究[D]. 向禮恩.西南大學(xué) 2013
[10]新疆野扁桃AlsCBF基因的克隆及功能驗證[D]. 李寧.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012



本文編號：3550505