目的利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除人胚腎（human embryonic kidney cell,HEK-293）細胞中DOC-1R,構(gòu)建DOC-1R敲除的HEK-293穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,用于進一步討論DOC-1R的生物學功能。方法根據(jù)CRISPR/Cas9設(shè)計原則,設(shè)計向?qū)NA（single-guide RNA,sgRNA）,構(gòu)建表達載體,對sgRNA測序并轉(zhuǎn)染包裝HEK-293T收集上清液測定病毒滴度。前期用Cas9-puro慢病毒感染HEK-293,用已制備的DOC-1R慢病毒感染穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9的HEK-293,72 h后顯微鏡下觀察HEK-293表達紅色熒光蛋白,并用Western blot檢測HEK-293中DOC-1R的表達以確定沉默效果。結(jié)果測序顯示插入的sgRNA序列正確,表達載體成功構(gòu)建,顯微鏡下觀察到,90%以上HEK-293表達紅色熒光蛋白,HEK-293中DOC-1R蛋白表達減少,確定了DOC-1R敲除效果最明顯的序列為GCCTACCTATGCTGGCAGCA。結(jié)論利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建DOC-1R基因敲除的細胞系,為進一步研究該基因的功能奠定了基... 

【文章來源】：解剖科學進展. 2020,26(03)

【文章頁數(shù)】：4 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 細胞系和主要試劑
    1.2 pLenti-DOC-1R-sgRNA-Cherry重組表達載體的構(gòu)建與鑒定
    1.3 DOC-1R慢病毒的制備及感染
    1.4 細胞總蛋白的提取、電泳及Western blot檢測
2 結(jié)果
    2.1 pLenti-DOC-1R-sgRNA-Cherry表達載體構(gòu)建
    2.2 在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白的表達情況
    2.3 Western blot檢測HEK-293細胞中DOC-1R表達
3 討論



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