發(fā)布時間：2021-12-17 07:16

　　目的:生物催化的氧化還原反應(yīng)廣泛應(yīng)用于手性化合物的制備,其中很多反應(yīng)涉及輔酶NADPH的原位再生。以異丙醇為輔助底物,利用醇脫氫酶再生NADPH,具有比酶活高、副產(chǎn)物丙酮易于分離等優(yōu)勢,受到越來越多的關(guān)注。選擇極具應(yīng)用潛力的來源于Clostridium beijerinckii的醇脫氫酶CbADH作為研究對象,針對其在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)差、酶活低的瓶頸問題開展研究。方法:首先通過引入誘導(dǎo)型質(zhì)粒p Gro7表達(dá)分子伴侶GroES-GroEL,將pET-28a(+)質(zhì)粒表達(dá)CbADH的可溶性提高了3.57倍,酶活達(dá)到出發(fā)菌株的4.83倍。其次,考察了另外三種不同的分子伴侶表達(dá)策略:pET-28a(+)單質(zhì)粒共表達(dá)、基因組強(qiáng)化表達(dá)GroES-GroEL和組成型改造pGro7/GroES-GroEL和pET-28a(+)/CbADH雙質(zhì)粒共表達(dá)。結(jié)果:組成型改造pGro7和pET-28a(+)雙質(zhì)粒共表達(dá)策略的效果最優(yōu),其CbADH的可溶性表達(dá)提高了8.07倍,酶活達(dá)到了21.79U/mg DCW,是出發(fā)菌株的9.43倍。結(jié)論:為CbADH的工業(yè)應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ),也為外源蛋白的可溶性表...

【文章來源】： 中國生物工程雜志. 2020,40(08)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：9 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株和質(zhì)粒
        1.1.2 主要試劑
        1.1.3 主要儀器
    1.2 方法
        1.2.1 Cb ADH表達(dá)菌株構(gòu)建
        1.2.2 分子伴侶與CbADH共表達(dá)菌株的構(gòu)建與培養(yǎng)
        1.2.3 pET單質(zhì)粒共表達(dá)菌株的構(gòu)建
        1.2.4 基因組強(qiáng)化表達(dá)Gro ES-GroEL菌株的構(gòu)建
        1.2.5 組成型p Gro7和pET雙質(zhì)粒共表達(dá)菌株的構(gòu)建
        1.2.6 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶
        1.2.7 菌體濃度測定
        1.2.8 細(xì)胞干重測定
        1.2.9 醇脫氫酶酶活測定
        1.2.1 0 SDS-PAGE蛋白電泳
        1.2.1 1 蛋白質(zhì)灰度分析
2 結(jié)果與分析
    2.1 Cb ADH在E.coli BL21(DE3)中的重組表達(dá)
    2.2 不同的分子伴侶蛋白對Cb ADH可溶性表達(dá)的影響
    2.3 p ET單質(zhì)粒共表達(dá)策略提高Cb ADH的可溶性表達(dá)
    2.4 基因組強(qiáng)化表達(dá)GroES-GroEL策略提高Cb ADH的可溶性表達(dá)
    2.5 組成型p Gro7和p ET雙質(zhì)粒共表達(dá)策略提高Cb ADH的可溶性表達(dá)
    2.6 分子伴侶GroES-GroEL的表達(dá)量與Cb ADH酶活的關(guān)系
3 結(jié)論



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