發(fā)布時(shí)間：2021-12-15 21:30

　　為了實(shí)現(xiàn)菊粉內(nèi)切酶在畢赤酵母（Pichia pastoris）中的高活性表達(dá)并對(duì)表達(dá)的菊粉內(nèi)切酶酶學(xué)性質(zhì)、水解菊粉的產(chǎn)物進(jìn)行分析。通過下載無花果曲霉菊粉內(nèi)切酶基因的編碼序列,做了密碼子優(yōu)化后進(jìn)行全基因合成,然后在畢赤酵母GS115中表達(dá)。對(duì)表達(dá)的菊粉內(nèi)切酶的酶活、最適反應(yīng)溫度、最適pH值、熱穩(wěn)定性進(jìn)行了分析,最后對(duì)酶水解菊粉的產(chǎn)物進(jìn)行了高效液相色譜（HPLC）分析。搖瓶表達(dá)的酶活力為420 U/mL,酶的最適反應(yīng)溫度為55℃,最適反應(yīng)pH為6.0。HPLC分析表明:表達(dá)的菊粉內(nèi)切酶酶解底物菊粉的主要產(chǎn)物為低聚果糖,聚合度為3～5之間。構(gòu)建的工程酵母可以高效表達(dá)菊粉內(nèi)切酶,可以用于生產(chǎn)低聚果糖。 

【文章來源】：井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2020,41(03)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

序列；b：密碼子優(yōu)化后序列圖1RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1TheRNAsecondarystructureprediction注：a：原始

為0.05，優(yōu)化后序列GC含量降低到52%，CAI提高到0.73。RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響基因的蛋白表達(dá)水平，用軟件RNAfoldServer預(yù)測(cè)優(yōu)化前后的基因序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)見圖1。從圖可知，優(yōu)化后的序列其結(jié)構(gòu)分支減少了，可以推測(cè)優(yōu)化后序列的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)較原來序列的結(jié)構(gòu)更優(yōu)，表達(dá)水平也可能更高。注：a：原始序列；b：密碼子優(yōu)化后序列圖1RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1TheRNAsecondarystructureprediction2.2菊粉內(nèi)切酶酶活將inu2基因克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K上，測(cè)序保證序列正確，見圖2。經(jīng)BglⅡ線性化轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，抗生素G418篩選高拷貝克攏SDS-PAGE分析表明，菊粉內(nèi)切酶基因表達(dá)的蛋白大小正確（圖3）。用DNS法對(duì)菊粉內(nèi)切酶的酶活進(jìn)行測(cè)定，酶活力為420U/mL。2.3酶學(xué)性質(zhì)研究將酶活的最大值設(shè)定為100%，在不同的溫度下（40、45、50、55、60、65、70℃）測(cè)定酶活，作出酶的最適反應(yīng)溫度曲線，如圖4所示，酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，在50~60℃范圍內(nèi)該酶活性較高；酶的熱穩(wěn)定性，酶在40℃條件下非常穩(wěn)定，溫浴72h酶仍然可以保持60%以上的活性，而50℃下溫浴12h后酶就僅剩下60%左右的活性，60℃下溫浴12h后酶的活性基本喪失；在不同pH（4.0~9.0）條件下測(cè)定酶的活性，將最高酶活設(shè)定為100%，作出酶的最適反應(yīng)pH曲線，如圖4所示，該酶的最適反應(yīng)pH為6.0，在低于pH4.0或高于9.0時(shí)則幾乎檢測(cè)不到活性。圖2密碼子優(yōu)化后序列測(cè)序圖Fig.2Sequencingdiagramofcodonoptimizedsequence

井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)37注：M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1：菊粉內(nèi)切酶蛋白圖3菊粉內(nèi)切酶蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.3SDS-PAGEofendoinulinaseprotein圖4菊粉內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度（a）和最適反應(yīng)pH值(b)Fig.4Optimalreactiontemperatureofendoinulinase(a)andoptimumpH(b)2.4酶水解菊粉產(chǎn)物分析酶水解菊粉產(chǎn)物的HPLC圖譜如圖5所示。由于只購買到聚合度為3-5的低聚果糖，因此在缺乏標(biāo)準(zhǔn)品的情況下沒有對(duì)聚合度大于5的糖進(jìn)行分析。從圖5可以看出酶水解菊粉的產(chǎn)物主要是聚合度為3-5的低聚果糖，此外還有少量聚合度大于5的低聚果糖。注：a：標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜；1：果糖；2：葡萄糖；3：蔗糖；4：蔗果三糖；5：蔗果四糖；6：蔗果五糖；b：菊粉內(nèi)切酶水解菊粉產(chǎn)物HPLC圖譜；1：果糖；2：蔗糖；3：聚合度為3的低聚果糖；4：聚合度為4的低聚果糖；5聚合度為5的低聚果糖；6：聚合度大于5的低聚果糖圖5菊粉水解產(chǎn)物HPLC圖譜Fig.5HPLCchromatogramofinulinhydrolysate3討論本研究利用異源基因表達(dá)技術(shù)對(duì)來自曲霉的基因在畢赤酵母中進(jìn)行了分泌表達(dá)，并對(duì)菊粉內(nèi)切酶基因inu2密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，構(gòu)建了畢赤酵母pPIC9K-inu2/GS115菌株，其表達(dá)的酶活力為420U/mL。還對(duì)inu2基因在釀酒酵母中的表達(dá)進(jìn)行過研究，但蛋白表達(dá)量和酶的活性都比較低，無法應(yīng)用于生產(chǎn)[15]。這說明菊粉內(nèi)切酶基因的表達(dá)受表達(dá)體系的影響較大，在不同體系中表達(dá)水平差異很大。外源基因表達(dá)效率受到密碼子偏好性的影響，不同物種密碼子偏好性不同，無花果曲霉與酵母就存在很大的差異，這種偏好性實(shí)質(zhì)反應(yīng)的是物種間不同轉(zhuǎn)運(yùn)tRNA含量的差異。如果基因含有稀有密碼子，而相應(yīng)的tRNA含量不足，就會(huì)導(dǎo)致基因表

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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