腈水合酶（nitrile hydratase,NHase,EC 4. 2. 1. 84）是一種金屬酶,能將腈類物質(zhì)催化水合生成酰胺類物質(zhì),在工業(yè)上主要應(yīng)用于煙酰胺和丙烯酰胺的生產(chǎn)。腈水合酶在應(yīng)用過程中,普遍存在熱穩(wěn)定性較差的缺陷,而腈類的水合催化屬于放熱反應(yīng),在工業(yè)催化過程中,過高的反應(yīng)溫度使得腈水合酶的催化效率、重復(fù)利用率均較低,故尋找一種耐熱型腈水合酶對工業(yè)應(yīng)用以及理論研究具有重要意義。該研究以提高腈水合酶熱穩(wěn)定性為出發(fā)點(diǎn),從美國國立生物技術(shù)信息中心通過BLAST篩選到一種新型耐熱腈水合酶,該腈水合酶來源為溫泉熱堿芽孢桿菌（Caldalkalibacillus thermarum TA2. A1）,該菌株最適生長溫度為65～70℃。將來源于Cal. thermarum TA2. A1的腈水合酶基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,基因合成后在大腸桿菌BL21（DE3）宿主中異源表達(dá),通過在該腈水合酶β亞基的C端添加strep標(biāo)簽成功純化該酶,測定其在65℃的半衰期為3 h,在30℃下催化煙腈的比酶活為395 U/mg,其全細(xì)胞催化反應(yīng)速率比已報(bào)道數(shù)據(jù)將近快1倍,煙酰胺的最終產(chǎn)量提高了25%,更有... 

【文章來源】：食品與發(fā)酵工業(yè). 2020,46(14)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

Cal.t NHase基因電泳圖

Cal.t NHase SDS-PAGE圖

不同的反應(yīng)溫度對Cal.t NHase酶活的影響如圖3-a所示，該酶最適溫度為37℃，且在35～40℃該蛋白酶活差異不大，在低溫下該蛋白酶活較低;不同的p H對Cal.t NHase酶活的影響如圖3-b所示，最適p H為7.0且在p H=6.0～7.5其比酶活變化不大。Cal.t NHase的熱穩(wěn)定性如圖3-c所示，來源于工業(yè)應(yīng)用菌株紅球菌R.rhodochrous J1的腈水合酶(H-NHase)在65℃下處理30 min完全喪失活性，來源于嗜熱假諾卡氏菌P.thermophila JCM 3095的腈水合酶(Pt-NHase)在65℃處理1 h殘余酶活僅為10%,Cal.t NHase在65℃下處理3 h仍能維持50%的酶活，相較于其他腈水合酶具有較好的熱穩(wěn)定性，對研究腈水合酶熱穩(wěn)定性具有重要參考價值。此外，良好的熱穩(wěn)定性能夠節(jié)約能耗、降低成本及提高菌體重復(fù)利用率，在工業(yè)應(yīng)用中具有重要意義。PEI等研究發(fā)現(xiàn)Pt NHase的β亞基第6個螺旋(Q111-G125)對腈水合酶熱穩(wěn)定性影響較大[10],Cal.t NHase、Pt NHase、Pp NHase、L-NHase、H-NHase相對應(yīng)的β亞基第六螺旋序列對比如圖4所示，從序列對比中可以看到此螺旋序列不保守，但熱穩(wěn)定性相對較好的Cal.t NHase、Pt NHase和L-NHase的L115、Q121和G126相對保守，可能是影響熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵位點(diǎn)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]高分子量腈水合酶在大腸桿菌中的表達(dá)策略及重組菌的細(xì)胞催化[J]. 張曉歡,崔文璟,周哲敏.  微生物學(xué)通報(bào). 2016(10)
[2]利用同源片段交換提高腈水合酶的熱穩(wěn)定性[J]. 房月芹,崔文璟,崔幼恬,陳艷,周哲敏.  中國生物制品學(xué)雜志. 2015(03)
[3]Rhodococcus rhodochrous J1腈水合酶在大腸桿菌中的表達(dá)策略[J]. 余越春,崔文璟,劉義,周哲敏.  工業(yè)微生物. 2014(02)

碩士論文
[1]重組大腸桿菌產(chǎn)腈水合酶發(fā)酵優(yōu)化及煙酰胺生產(chǎn)工藝的建立[D]. 王哲.江南大學(xué) 2017
[2]高分子量腈水合酶的異源表達(dá)、全細(xì)胞催化及分子改造[D]. 張曉歡.江南大學(xué) 2016



本文編號：3513622