基因敲入技術(shù)主要是利用人為導(dǎo)入基因修復(fù)所依賴(lài)的同源序列,借助細(xì)胞自身的DNA同源重組修復(fù)機(jī)制,實(shí)現(xiàn)外源基因的定點(diǎn)插入。新一代CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是一種操作簡(jiǎn)便、精度較好、效率較高、安全性較好的基因敲入、敲除、修飾技術(shù),目前主要通過(guò)以下5種方式介導(dǎo)基因的靶向整合,即同源重組（homologous recombination,HR）、微同源末端連接（Microhomology-mediated end joining,MMEJ）、非同源末端連接（Non-homologous end joining,NHEJ）、同源末端連接（Homology-mediated end joining,HMEJ）以及單鏈DNA（Single-stranded oligodeoxynucleotides,ss ODNs）。本研究利用Spacer18（C18）能與核苷酸鏈相連接的特點(diǎn),開(kāi)發(fā)出C18同源模板介導(dǎo)基因敲入的新方法,通過(guò)設(shè)計(jì)含有C18的單鏈核苷酸引物,以敲入基因?yàn)槟０?利用PCR產(chǎn)生兩端含有黏性末端的C18同源模板�；诖�,對(duì)C18同源模板、HR、MMEJ、NHEJ、HMEJ以及ss OD... 

【文章來(lái)源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：78 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

Cas9PAM序列及引入DSB的位置（Komoretal,2017）

種基因敲入方法示意圖（Yaoetal,2017a）

第二章6種基因敲入方法的效率比較152.2試驗(yàn)方法2.2.1sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建2.2.1.1sgRNA的設(shè)計(jì)從NCBI上選取小鼠GAPDH基因（GeneID:14433）的3’UTR序列，利用在線sgRNA設(shè)計(jì)工具（http://crispr.mit.edu/），滿足PAM序列為NGG的基本條件，根據(jù)評(píng)分和位置選擇4426-4445處CAGGGTTTCTTACTCCTTGG為本試驗(yàn)的sgRNA，然后設(shè)計(jì)退火引物，在退火引物上游5’端加accg序列，在下游添加aaac序列，將設(shè)計(jì)好的序列發(fā)送給西安擎科生物有限公司合成。將得到的引物稀釋到100μM，保存于4℃冰箱。2.2.1.2U6-sgRNA載體構(gòu)建（1）PGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin載體酶切線性化。該載體用于真核表達(dá)，且在317和342位置具有BsaI酶切位點(diǎn)，質(zhì)粒圖譜如圖2-2所示。圖2-2PGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin載體圖譜Fig.2-2PGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycinplasmidvector使用BsaI酶對(duì)該載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切體系如下：成分用量PGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin質(zhì)粒10μgCutSmartBuffer5μLBsaI1μLddH2OTo50μL以上各成分混勻后于37℃恒溫水浴鍋中過(guò)夜酶切，根據(jù)環(huán)狀質(zhì)粒與線性化質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳的遷移率不同，利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切是否充分；用Cycle-PureKit（Omega）試劑盒回收酶切后的線性化質(zhì)粒。（2）將公司合成的sgRNAoligo單鏈引物稀釋至100μM，使用PCR儀進(jìn)行退火，退火后形成帶有粘性末端的雙鏈。得到的雙鏈sgRNA的粘性末端與BsaI酶切后線性


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