半乳糖苷酶是一種水解半乳糖苷鍵的糖苷酶,在食品、藥品和造紙等工業(yè)中應(yīng)用廣泛,可降解半乳聚糖和半乳寡糖等。同時,也可以用于多糖結(jié)構(gòu)修飾和解析中。阿拉伯半乳聚糖在植物組織中含量豐富,功能多樣,是一種重要的半乳聚糖。阿拉伯半乳聚糖的構(gòu)效關(guān)系研究一直受限于其結(jié)構(gòu)分析,所以尋找專一性好的半乳糖苷酶對研究其構(gòu)效關(guān)系具有重要意義。植物乳桿菌作為一種腸道益生菌能夠代謝半乳聚糖,基因組學(xué)研究表明其含有多種β-半乳糖苷酶基因。本論文對其β-半乳糖苷酶進行重組表達和酶學(xué)性質(zhì)研究,以期發(fā)現(xiàn)和制備能夠用于分析阿拉伯半乳聚糖的酶。具體研究成果如下:1.以植物乳桿菌基因組為模板,成功克隆出兩個β-半乳糖苷酶基因lpgal42和lpgal2,分別屬于糖苷水解酶家族42（GH42）和家族2（GH2）。將目的基因與pET-28a（+）載體連接后轉(zhuǎn)移到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中,獲得重組菌株lpgal42-pET-28a（+）-BL21（DE3）和lpgal2-pET-28a（+）-BL21（DE3）。重組菌株在25℃ 0.5mM IPTG條件下誘導(dǎo)16 h,可實現(xiàn)重組蛋白LpGal42和LpGal2的可溶性表... 

【文章來源】：東北師范大學(xué)吉林省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

糖苷水解酶保持型和反轉(zhuǎn)型催化機制[35]

櫻?鈧招緯砂肴樘嗆推咸煙恰Ｈ綣??成的半乳糖-酶中間體隨后將半乳糖傳遞給其他合適的親核試劑，那么就會合成半乳寡糖（Galacto-OligosaccharidesGOS）。在合成寡糖的過程中，初始反應(yīng)時溶液中乳糖濃度比較高，所以親核試劑一般是乳糖，但隨著反應(yīng)的進行，產(chǎn)物中的葡萄糖、半乳糖或者半乳寡糖也可以作為親核試劑參與反應(yīng)，從而形成聚合度和糖苷鍵不同的GOS。除此之外，還可以利用β-半乳糖苷酶的水解活性來制備GOS，如一些外切-β-1,3-半乳聚糖酶可以繞過側(cè)鏈去降解AG-II的主鏈，降解過程中可釋放出側(cè)鏈的β-1,6-半乳寡糖。圖1-2水解反應(yīng)及糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)示意圖[60]利用β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基活性或水解活性制備的GOS是一種不易被消化的益生元，能夠促進乳酸桿菌和雙歧桿菌等有益菌的生長[30]，進而減少病原菌的數(shù)量，提高免疫力[61]。研究顯示，GOS對人的健康多有益處，例如，它能夠降低人糞便的pH，預(yù)防齲病，降低血清膽固醇水平等。因此在食品產(chǎn)業(yè)中，GOS常被用作為嬰兒奶、谷物類食物和軟飲料等的添加成分以及低卡路里的甜味劑。目前，商業(yè)化的GOS大多是通過酶促反應(yīng)合成的，具有良好的選擇性[62]。3．用于乳清加工乳品工業(yè)在生產(chǎn)奶酪時會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——乳清，乳清中的主要成分為乳糖、礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)，盡管有一部分乳清用于生產(chǎn)濃縮蛋白，但全世界產(chǎn)生的大量乳清被當(dāng)做廢物排放入水中，造成水污染和資源的浪費[63]，在β-半乳糖苷酶的作用下，他們可以轉(zhuǎn)化成有應(yīng)用價值的乙醇[64]，還可以轉(zhuǎn)化成細胞培養(yǎng)的有效底物[65]。乳清通過超濾可以獲得高功能的乳清蛋白，通過進一步的水解可以產(chǎn)生藥物中間體[66]。β-半乳糖苷酶還能夠水解乳清中的乳糖，將乳清乳糖轉(zhuǎn)化為許多合適的產(chǎn)品，如用于面包廠和糖果廠的甜糖漿。4．促進水果軟化和成熟

作為報告基因方面也有相應(yīng)的應(yīng)用。大腸桿菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可將X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）水解成5-溴-4-氯-3-羥基吲哚和半乳糖，而生成的5-溴-4-氯-3-羥基吲哚會自發(fā)形成二聚體，該二聚體氧化后會形成深藍色的物質(zhì)。因此，β-半乳糖苷酶基因可作為載體組成的一部分，當(dāng)外源基因插入半乳糖苷酶基因后，就無法合成有活性的β-半乳糖苷酶，也就無法水解X-Gal。根據(jù)菌落的顏色便可以判斷外源基因是否插入成功。β-半乳糖苷酶基因還可以作為報告基因來研究啟動子的效能，研究表達系統(tǒng)中增強序列的功能等[73]。圖1-3β-半乳糖苷酶水解X-Gal示意圖[74]1.2植物乳桿菌概述乳酸菌是一類能利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的細菌的統(tǒng)稱，其種類繁多，包括至少18個屬，共200多種。部分研究表明，某些乳酸菌菌株，特別是乳酸桿菌屬的菌株，會利于人類和動物的健康[75]。乳桿菌屬中包含了大量的物種，表現(xiàn)出較高的多樣性[76]，其中，植物乳桿菌在不同的生態(tài)位中均有分布，在乳制品，肉類，蔬菜和植物的發(fā)酵過程中扮演重要角色。此外，植物乳桿菌還是人類腸道中的益生菌，與人類的健康息息相關(guān)[77,78]。1.2.1植物乳桿菌生物學(xué)特性植物乳桿菌是一種不產(chǎn)氣，非孢子型的乳酸菌，屬于革蘭氏陽性細菌[79]，是厭氧或兼性厭氧的化能異養(yǎng)型細菌，其生長需要從外界獲取糖、氨基酸、維生素等物質(zhì)來滿足自身生長和代謝的需要。植物乳桿菌的最適生長溫度為30-35oC，最適生長pH為6.5左

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：3493895