L-氨基酸是非常重要的醫(yī)藥中間體,其合成方法受到廣泛關(guān)注。來源于Pseudomonas dacunhae的L-天冬氨酸β-脫羧酶（ABDC）可以催化L-天冬氨酸發(fā)生β-脫羧反應(yīng)生成L-丙氨酸并釋放二氧化碳,目前該酶已用于L-丙氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)。1963年,Wilson和Kornberg首次報道了來源于Achromobscter的L-天冬氨酸β-脫羧酶可以催化蘇式和赤式-β-羥基-DL-天冬氨酸發(fā)生β-脫羧作用生成L-絲氨酸。由此受到啟發(fā),我們猜想ABDC是否能夠催化其它天冬氨酸衍生物合成更多類型的L-氨基酸?因此,本文的研究目的首先是探索ABDC催化的底物譜范圍,進(jìn)一步地通過半理性設(shè)計對其進(jìn)行分子改造,提高其合成L-高苯丙氨酸等L-氨基酸的能力。首先,我們對天然酶催化的底物譜進(jìn)行探索,通過UPLC-MS鑒定發(fā)現(xiàn)天然酶可以催化3-位取代的天冬氨酸-β-羧基脫除反應(yīng)。測定了酶對3-位取代天冬氨酸衍生物的比活力,發(fā)現(xiàn)天然酶更傾向于催化3-羥基-DL-天冬氨酸的β-脫羧,但其比活力僅為天然底物L(fēng)-天冬氨酸的千分之一。其次,鑒于天然酶對非天然底物催化效率偏低的問題,我們以化學(xué)合成并拆分獲得的大位... 

【文章來源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．１含有手性Ｌ－氨基酸結(jié)構(gòu)單元的藥物??Ｆｉｇ．?１．１?Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ?ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ?ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ?ｃｈｉｒａｌ?Ｌ＇ａｍｉｎｏ?ａｃｉｄｓ．??

與討論??２．４．１蛋白純化??如上２．３．６的方法，用含不同濃度咪唑的純化緩沖液洗脫鎳柱，己知目的蛋白的分??子量為６０?ｋＤａ左右。洗脫條件如下：（１）７５?ｍＭ?（１５％?Ｂ）咪唑用來洗脫雜蛋白；（２）２０％??Ｂ－６０％?Ｂ洗脫液中均含有目的蛋白，我們確定后期實驗中用３００?ｍＭ?（６０％?Ｂ）咪唑洗脫??目的蛋白。（３）洗脫體積約３５?ｍＬ?（１７倍柱體積）基本可以將目的蛋白全部洗脫下來（圖??２．３）。??ＫＤａ?Ｍｌ?２３４５６７８９?１０?１１??Ｉ?＂…—??圖２．３蛋白質(zhì)純化電泳圖??Ｆｉｇ．?２．３?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｅｌｕｅｎｔｓ?ｅｌｕｔｅｄ?ｂｙ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｉｍｉｄａｚｏｌｅ．??Ｌａｎｅ?１：?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；?Ｌａｎｅ?２：?ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ；?Ｌａｎｅ?３：?ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ；?Ｌａｎｅ?４：?５％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?５：?１５％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；??Ｌａｎｅ?６：?２０％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?７：?３０％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?８：?４０％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?９：?５０％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?１０：?６０％??Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?１１：?７０％?Ｂ?ｅｌｕｅｎｔ；?Ｌａｎｅ?Ｍ：?ｍａｒｋｅｒ．??２．４．２氨基酸與衍生化試劑ＧＩＴＣ的添加比例摸索??為保證ＨＰＬＣ檢測氨基酸濃度的準(zhǔn)確性，需要確保所有的氨基酸均被衍生化。因此，??我們對衍生化體系中氨基酸與ＧＩＴＣ的添加比例進(jìn)行摸索。以Ｌ－天冬氨酸和Ｌ－丙氨酸為??例設(shè)計實驗，如表２．

華東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文?第２５頁??２．４．４?Ｌ－天冬氨酸Ｐ－脫羧酶對非天然氨基酸底物的反應(yīng)進(jìn)程圖??ｕＶｆｘｌ?００．０００）???，ｎ?３（／？，５＞甲基－ＤＬ－天冬氨酸丨；??２０?ｊ＼?八Ｌ－２－氣基丁酸??：?Ｌ－２－氨基丁酸標(biāo)品／＼????０．０?２．５?５．０?７．５?１０．０?１２．５?ｍｉｎ??圖２．５?甲基－ＤＬ－天冬氨酸的反應(yīng)進(jìn)程圖??Ｆｉｇ．?２．５?Ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｐｒｏｇｒｅｓｓ?ｏｆ?ＳＣ／＾＾－ｍｅｔｈｙｌ－ＤＬ－ａｓｐａｒｔｉｃ?ａｃｉｄ．??商品化的３（／？，５＞甲基－ＤＬ－天冬氨酸和３（／？，５＞羥基－ＤＬ－天冬氨酸均為外消旋體，我們??以這兩個底物為例，通過液相色譜監(jiān)測其反應(yīng)過程。經(jīng)液相色譜分析，我們檢測到３（／？，５＞??甲基－ＤＬ－天冬氨酸的兩個峰，其峰面積基本相等。我們可以觀察到其中一種構(gòu)型的底物??在反應(yīng)過程中逐漸減少，產(chǎn)物Ｌ－２－氨基丁酸的濃度逐漸增加（圖２．５）。１９６４年，??Ｎｏｖｏｇｒｏｄｓｋｙ和Ｍｅｉｓｔｅｒ的研宄結(jié)果表明源于為ｅｃｏ／ｋ的天冬氨酸Ｐ－脫竣酶對??蘇式－Ｐ－甲基－Ｌ－天冬氨酸沒有活力ＩＨ，而本文中來源于Ｚ３?ＡｃｍＭｅ的天冬氨酸Ｐ－脫羧酶??則可以催化３（／？，５＞甲基－ＤＬ－天冬氨酸發(fā)生卜脫狻作用生成Ｌ－２－氨基丁酸，根據(jù)產(chǎn)物構(gòu)型??可以推測發(fā)生反應(yīng)的底物應(yīng)為３（／？，５＞甲基－Ｌ－天冬氨酸（兩種構(gòu)型或其中的一種構(gòu)型）。商??品化的３（／？，５＞羥基－ＤＬ－天冬氨酸是四種構(gòu)型的混合物，由液相色譜圖可知（圖２．６），在６??ｈ后產(chǎn)物濃度不再增加，反應(yīng)基本停止。２０１０年，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ利用快速動力學(xué)停留光譜

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]L-天冬氨酸脫羧酶研究進(jìn)展[J]. 高麗娟,裘娟萍.  工業(yè)微生物. 2007(05)



本文編號：3485684