傳統(tǒng)構(gòu)建畢赤酵母質(zhì)粒多拷貝菌株的方法不僅操作復(fù)雜、成本高,而且難以獲得理想中的高拷貝菌株.近來,一種利用leu2-d缺陷型標(biāo)記直接篩選畢赤酵母多拷貝克隆的方法顯示出很大的便利.本研究發(fā)現(xiàn),使用一個(gè)lys1-d缺陷型標(biāo)記能更加高效地介導(dǎo)畢赤酵母超高拷貝質(zhì)粒整合.首先構(gòu)建一個(gè)攜帶lys1-d和EGFP（enhanced green fluorescent protein）報(bào)告基因的整合載體,然后將載體轉(zhuǎn)化至敲除了內(nèi)源lys1基因的畢赤酵母中,最后分別檢測(cè)了轉(zhuǎn)化子內(nèi)EGFP含量和質(zhì)�？截悢�(shù).結(jié)果顯示,所有轉(zhuǎn)化子整合的質(zhì)粒拷貝數(shù)均處于19～168之間;并且轉(zhuǎn)化子內(nèi)質(zhì)�？截悢�(shù)越高,其胞內(nèi)表達(dá)的EGFP產(chǎn)量也越高.這一系統(tǒng)為構(gòu)建畢赤酵母超高拷貝質(zhì)粒整合菌株增添了有效的工具. 

【文章來源】：湖北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2020,42(05)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

p GK1-lys1-d-EGFP載體圖譜

將構(gòu)建成功的pPpT4＿pHTX1-PARS1-hsCas9-LYS1gRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33菌株，在含有終濃度為100 ng/μL博來霉素的YPD平板上生長(zhǎng)3 d，任意挑取一個(gè)單菌落提取其基因組并測(cè)序．測(cè)序結(jié)果如圖2A所示，可以看出在基因組上gRNA靶向位置發(fā)生“TA”雙堿基缺失突變(將此突變株命名為XL1)．為了確認(rèn)該菌株的表型，將其分別劃線于MD和添加L-賴氨酸(終濃度0.04%)的MD培養(yǎng)基，結(jié)果顯示(如圖2B)，突變株無法在缺少L-賴氨酸的MD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，證明lys1基因成功敲除．2.2 質(zhì)粒整合

隨即，又對(duì)這6個(gè)菌株表達(dá)外源蛋白的產(chǎn)量與整合的質(zhì)粒拷貝數(shù)做了相關(guān)性分析．結(jié)果顯示，這些菌株中質(zhì)粒拷貝數(shù)與蛋白產(chǎn)量呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性(如圖5.R2>0.99)．從圖中可以觀察到整合了167.58個(gè)拷貝的Clone6，其熒光強(qiáng)度高達(dá)1 368 732，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于整合19.81個(gè)拷貝的Clone4的熒光強(qiáng)度100 318．這些結(jié)果表明，lys1-d缺陷型標(biāo)記能有效地介導(dǎo)畢赤酵母超高拷貝質(zhì)粒整合從而增加EGFP的表達(dá)．圖4 PGK1啟動(dòng)子與met2基因拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線


本文編號(hào)：3473149