木栓質(zhì)是由甘油、脂肪族、酚類(lèi)化合物等組成的植物次生代謝產(chǎn)物,廣泛存在于植物根部,也出現(xiàn)在表皮和周皮等部位,與地上部分存在的角質(zhì)共同構(gòu)成了植物為適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境變化而形成的疏水性屏障。木栓質(zhì)與植物的多種抗性相關(guān),對(duì)木栓質(zhì)的研究有助于闡釋植物抗性機(jī)理和提升植物抗性,然而目前相關(guān)的研究多集中于擬南芥中,其他物種中的報(bào)道較少。前期研究表明:二穗短柄草Bd FAR4基因在酵母及番茄中被證實(shí)參與木栓質(zhì)初級(jí)脂肪醇的合成,但該基因詳細(xì)的功能研究仍有待揭示。二穗短柄草是麥類(lèi)作物重要的模式植物,對(duì)Bd FAR4的研究可為麥類(lèi)作物的相關(guān)研究提供參考。本文在前人研究的基礎(chǔ)上對(duì)Bd FAR4的功能展開(kāi)了進(jìn)一步研究分析。我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和過(guò)量表達(dá)技術(shù)結(jié)合二穗短柄草的遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)Bd FAR4進(jìn)行了功能驗(yàn)證;對(duì)Bd FAR4蛋白進(jìn)行原核表達(dá);通過(guò)亞細(xì)胞定位技術(shù)在擬南芥原生質(zhì)體和煙草表皮細(xì)胞中確定了Bd FAR4蛋白的定位信息;對(duì)二穗短柄草進(jìn)行了多種非生物脅迫處理,探究了Bd FAR4在各脅迫條件下的表達(dá)變化。本文的主要結(jié)論如下:1.CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功編輯了二穗短柄草Bd21植株的Bd... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

技術(shù)路線圖

第二章二穗短柄草BdFAR4基因的功能驗(yàn)證19圖2-1BdFAR4基因結(jié)構(gòu)及CRISPR/Csa9靶點(diǎn)示意圖Fig.2-1SchematicofBdFAR4genestructureandCRISPR/Csa9target表2-6接頭引物信息Table2-6Adapterprimerinformation引物名稱(chēng)引物序列U6a-gRNA-T1-F5’-GCCGAAGCTCTTCCTCTTGGTCC-3’U6a-gRNA-T1-R5’-AAACGGACCAAGAGGAAGAGCTT-3’U3-gRNA-T2-F5’-GGCATGTCGAATCGGCAAAGCTT-3’U3-gRNA-T2-R5’-AAACAAGCTTTGCCGATTCGACA-3’（2）gRNA表達(dá)盒的構(gòu)建和擴(kuò)增人工合成接頭引物，用TE緩沖液稀釋為100μM的母液，各取1μL加入98μL0.5×TE緩沖液混合，約90℃處理30s，隨后在室溫中冷卻以完成退火。取U6a-gRNA，U3-gRNA載體質(zhì)粒各0.5~1μL，在20μL反應(yīng)體系中用5~10UBsaI酶切處理20min，70℃處理5min使酶失活，冷凍保存?zhèn)溆�。酶切后的各載體與對(duì)應(yīng)的接頭在表2-7體系中室溫連接10~20min以完成gRNA表達(dá)盒連接反應(yīng)。表2-7連接反應(yīng)體系Table2-7Ligationreactionsystem試劑用量（μL）10×T4buffer1.0gRNA載體0.5對(duì)應(yīng)接頭1.0ddH2O7.4T4連接酶0.1總體積10.0取2μL連接產(chǎn)物、KOD酶和各0.3μM的引物配制成15μLPCR體系各自進(jìn)行第一輪擴(kuò)增反應(yīng)，引物使用1F：5’‐CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG‐3’；1R：5’‐CGGAGGAAAATTCCATCCAC‐3’。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃1min，95℃15s、55℃

西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文26圖2-2二穗短柄草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)Fig.2-2CallusinductioncultureofB.distachyonA：培養(yǎng)初期；B、C：培養(yǎng)后期A:Earlyculture;B,C:Lateculture2.2.1.2愈傷組織的繼代培養(yǎng)在誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后，挑選鮮黃致密的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，使愈傷塊的數(shù)量增加。將未成熟胚誘導(dǎo)獲得的鮮黃致密的大塊愈傷組織分成許多愈傷小塊，整齊擺放在新的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（圖2-3A、B）。待小塊愈傷組織長(zhǎng)大后，可進(jìn)行第二次繼代培養(yǎng)，使愈傷組織的數(shù)量進(jìn)一步增加。繼代培養(yǎng)完成后，收集鮮黃致密的愈傷組織（圖2-3C）進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染。圖2-3二穗短柄草愈傷組織繼代培養(yǎng)Fig.2-3CallussubcultureofB.distachyonA、B：繼代培養(yǎng)；C：鮮黃致密的愈傷組織A,B:Callussubculture;C:Brightyellowdensecallus2.2.1.3侵染后愈傷組織的篩選培養(yǎng)經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌侵染的愈傷組織進(jìn)行共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩眩潮霉素抗性基因是載體的報(bào)告基因，只有被成功轉(zhuǎn)化后具有潮霉素抗性的愈傷組織才能在篩

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]鎘脅迫對(duì)鹽芥根木栓質(zhì)代謝的影響[J]. 陳寧美,歐陽(yáng)舒毓,徐維烈,唐帥,韋善君,馮金朝,徐小靜.  河南農(nóng)業(yè)科學(xué). 2018(10)
[2]CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)及在農(nóng)作物品種改良研究中的應(yīng)用[J]. 郝麗芬,房永雨,燕孟嬌,皇甫海燕,宋培玲,賈曉清,皇甫九茹,李子欽,韓冰.  北方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2017(03)
[3]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao.  Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)

博士論文
[1]小麥超長(zhǎng)鏈脂肪酰輔酶A還原酶基因TaFAR的同源克隆與功能分析[D]. 柴乖強(qiáng).西北農(nóng)林科技大學(xué) 2018

碩士論文
[1]二穗短柄草根中木栓質(zhì)脂肪醇合成基因的克隆與功能驗(yàn)證[D]. 羅文巧.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2018
[2]CYP86A1在擬南芥響應(yīng)干旱脅迫中的作用研究[D]. 高麗.蘭州大學(xué) 2018
[3]二穗短柄草（Brachypodium distachyon）Bra1基因的克隆、表達(dá)特征分析及其基因編輯體系的建立[D]. 劉瑤瑤.江蘇大學(xué) 2018
[4]小麥表皮蠟質(zhì)β-酮脂酰輔酶A合成酶KCS基因的克隆與功能分析[D]. 夏凌峰.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2017



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