檢測GT1-7細(xì)胞中miR-29對GnRH啟動子區(qū)域甲基化的影響,探究GnRH特定位點(diǎn)的甲基化與其表達(dá)量的相關(guān)性。采用重亞硫酸鹽測序（BSP）結(jié)合二代測序技術(shù)（NGS）的方法檢測GT1-7及miR-29敲除的GT1-7（miR-29KO-GT1-7）細(xì)胞中GnRH啟動子區(qū)7個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度。根據(jù)測序結(jié)果,利用CRISPR-dCas9技術(shù)在差異顯著的CpG6位點(diǎn)特異性富集Dnmt3a、Tet1,并通過二代測序檢測該位點(diǎn)甲基化變化,同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測GnRH的表達(dá)量,驗(yàn)證二者之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示:在miR-29KO-GT1-7細(xì)胞中,與對照組相比,在CpG6位點(diǎn)富集Dnmt3a后其甲基化水平上升17%,GnRH的表達(dá)水平下降40%（P<0.01）;在GT1-7細(xì)胞中,CpG6位點(diǎn)富集Tet1,可使其甲基化水平下降20%,GnRH的表達(dá)水平上升50%（P<0.05）。結(jié)果表明miR-29可通過影響GnRH啟動子DNA甲基化水平尤其是特定CpG位點(diǎn)的甲基化程度調(diào)控GnRH的表達(dá),為進(jìn)一步研究解析性發(fā)育的調(diào)控提供了新的表觀遺傳機(jī)制。 

【文章來源】：生物學(xué)雜志. 2020,37(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

CRISPR-dCas9-Dnmt3a(a)/Tet1(b)過表達(dá)載體的構(gòu)建

針對GnRH啟動子區(qū)的CpG6位點(diǎn)和CpG2位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)sgRNA(sgRNA-CpG6、sgRNA-CpG2),針對Sp1基因的sgRNA-Sp1用作實(shí)驗(yàn)對照,將sgRNA構(gòu)建到42230-EGFP載體上獲得重組載體,sgRNA設(shè)計(jì)及引物序列詳情見圖3和表3。載體送上海生工生物有限公司測序鑒定后使用。1.2.5 CRISPR-dCas9-Dnmt3a/Tet1載體和42230-sgRNA-EGFP載體的共轉(zhuǎn)染

利用Methyl Primer軟件和Oligo 7軟件在線設(shè)計(jì)BSP引物,分成5個(gè)區(qū)段(M1、M2、M3、M4、M5)PCR擴(kuò)增GnRH基因啟動子-1005～+1的7個(gè)CpG位點(diǎn)。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性 15 min;98 ℃ 變性15 s,55 ℃ 退火1 min,72 ℃ 延伸30 s,共40個(gè)循環(huán);72 ℃ 再延伸10 min。擴(kuò)增區(qū)段詳見圖1,BSP引物序列見表1。表1 BSP引物Table 1 Primer sequences of BSP 引物Primer 引物序列(5′-3′)Primer Sequence GnRH-M1-F ACGACGTGTCGAGTTCAGGTATTAGTTTGGTTTATATAGTTTTAGG GnRH-M1-R CAGTGAGTCGCCACAGGTCAAATACACTACCGCTATCTTCAAAC GnRH-M2-F ACGACGTGTCGAGTTCAGGTATTATTTTTAGTGGGATTTGATG GnRH-M2-R CAGTGAGTCGCCACAGGTCATACCACCACACCTAACTTAATT GnRH-M3-F ACGACGTGTCGAGTTCAGGTATAATTAAGTTAGGTGTGGTGGT GnRH-M3-R CAGTGAGTCGCCACAGGTCAAACCCACTTTATAAACCAATCT GnRH-M4-F ACGACGTGTCGAGTTCAGGTTGGGTTTTAGGATAGTTAGGGT GnRH-M4-R CAGTGAGTCGCCACAGGTCATAAACAAACACACACACACAAA GnRH-M5-F ACGACGTGTCGAGTTCAGGTTTATTTGTTTGTGTGAATGTGTT GnRH-M5-R CAGTGAGTCGCCACAGGTCATAAATTCTATCCCAAAATCCC 注:粗斜體為通用序列(由無錫翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司提供)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控中的意義及研究進(jìn)展[J]. 鐘焱,徐慧,彭鳳蘭.  中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào). 2019(14)



本文編號：3470957