大腸埃希氏菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7,E.coli O157:H7）是一種非常重要的食源性致病菌。目前已有標準和快速的檢測技術(shù),但仍存在較多可提升的空間。融合多領(lǐng)域新知識、材料和技術(shù),研發(fā)出多方面性能良好,特別是能夠同時實現(xiàn)定性定量分析的技術(shù),對于快速檢測具有重大意義。近年來,氣體免疫傳感器因其具有環(huán)保、靈敏、簡便等優(yōu)點,逐漸受到相關(guān)科研人員的關(guān)注;新型多功能納米酶亦是在快速檢測領(lǐng)域備受重視�；诖�,本課題研發(fā)了3種操作簡單、檢測成本低、檢測結(jié)果準確且具有創(chuàng)新性的快速檢測方法,均很好地實現(xiàn)了E.coli O157:H7的定性定量檢測。具體研究內(nèi)容如下:1、基于Au@Pt納米酶ELISA/H₂O₂→O₂↑/SDS免疫夾心泡沫法定性/量快速檢測E.coli O157:H7本章通過將泡沫生成反應(yīng)指示系統(tǒng)與病原體識別組分相結(jié)合,利用低成本的測量工具-直尺直接測量泡沫高度的變化,研發(fā)了一種泡沫免疫分析技術(shù),可同時實現(xiàn)定性定量檢測E.coli O157:H7。用修飾了鼠抗E.coli O157... 

【文章來源】：浙江工商大學(xué)浙江省

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

過氧化氫酶與PtNPs表觀周轉(zhuǎn)數(shù)（kcat）比較

21細菌濃度，菌落單位為CFU·mL-1。經(jīng)過兩次活化的培養(yǎng)物4C下以6000rpm離心10min，用5mL含0.5%甲醛的生理鹽水作為滅活細菌制劑，37C下滅活上述細菌懸浮液12h，這確保了實驗室人員的人身安全。隨后將其離心并重新分散在5mL生理鹽水中，并儲存在4°C環(huán)境下。通過滅活細菌細胞來評估所開發(fā)的泡沫免疫測定的條件和性能。同樣地，用C.sakazakii，C.freundii，L.monocytogenes，S.putrefaciens，B.subtilis和B.cereus用于對照實驗。2.1.7免疫夾心泡沫法實驗流程圖2.1制備（A）Au@PtNP，（B）mAb2-Au@Pt/SiO2NP，（C）夾心免疫反應(yīng)檢測E.coliO157:H7和（D）泡沫法快速定量檢測E.coliO157:H7的工作原理圖Fig.2.1Aschematicillustrationofthefabricationprocessof(A)Au@PtNP,(B)mAb2-Au@Pt/SiO2NP,(C)sandwichimmunereactionfordetectionofE.coliO157:H7usingMIcsand(D)mAb2-Au@Pt/SiO2NPandworkingprincipleoffoamimmunoassayforrapidandquantitativedetectionofE.coliO157:H7免疫夾心泡沫法測定過程見圖2.1C和圖2.1D。首先，將30μLMIc（10mg·mL-1）與3mLE.coliO157:H7選擇性增菌液混合，并在37C溫和振蕩下孵育30min，然后將復(fù)合物用PBST洗滌3次，加入5μLmAb2-Au@Pt/SiO2NP并在37C下再孵育30min。

22同樣的，將復(fù)合物用PBST洗滌3次并用磁鐵分離，然后用50μLPBS重懸后，將夾心復(fù)合物轉(zhuǎn)移到96孔板中。將60μL30%H2O2溶液和50μL16mmol·mL-1SDS加入到孔中，迅速用硅膠塞密封，立即插入亞克力細管。在室溫下反應(yīng)25min后，用尺子測量亞克力細管中O2與SDS所形成泡沫的高度，所有數(shù)據(jù)均通過3次平行測量分析獲得。2.2結(jié)果和討論2.2.1免疫夾心泡沫法的原理免疫夾心泡沫法的檢測原理如圖2.1所示，定量檢測只用了96孔板，硅膠塞和亞克力細管。具體裝置如圖2.1D所示，用硅膠塞密封孔，然后插入亞克力細管。該夾心型泡沫免疫測定法由MIc選擇性富集和分離待測菌，并與mAb2-Au@Pt/SiO2NP結(jié)合形成夾心免疫結(jié)構(gòu)。Au@PtNP具有將H2O2分解成H2O和O2的優(yōu)異催化能力，產(chǎn)生的O2被表面活性劑SDS捕獲并轉(zhuǎn)化為泡沫，繼而通過壓力將泡沫推進亞克力細管中，產(chǎn)生肉眼可見并方便測量的高度變化。泡沫的高度與待測目的菌E.coliO157:H7的濃度直接相關(guān)，通過測量泡沫的高度來實現(xiàn)定性定量檢測目標物的濃度。2.2.2MNP和Au@Pt/SiO2NP的表征圖2.2（A）磁珠的透射電鏡圖；（B）磁珠的紅外光譜圖Fig.2.2(A)TheTEMimageofMNP;(B)TheFTIRspectraofMNP

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]快速檢測農(nóng)產(chǎn)品中大腸桿菌O157：H7的生物傳感方法與儀器研究[D]. 王一嫻.浙江大學(xué) 2013



本文編號：3460097