大腸埃希氏菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7,E.coli O157:H7）是一種非常重要的食源性致病菌。目前已有標(biāo)準(zhǔn)和快速的檢測(cè)技術(shù),但仍存在較多可提升的空間。融合多領(lǐng)域新知識(shí)、材料和技術(shù),研發(fā)出多方面性能良好,特別是能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)定性定量分析的技術(shù),對(duì)于快速檢測(cè)具有重大意義。近年來(lái),氣體免疫傳感器因其具有環(huán)保、靈敏、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),逐漸受到相關(guān)科研人員的關(guān)注;新型多功能納米酶亦是在快速檢測(cè)領(lǐng)域備受重視�；诖�,本課題研發(fā)了3種操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確且具有創(chuàng)新性的快速檢測(cè)方法,均很好地實(shí)現(xiàn)了E.coli O157:H7的定性定量檢測(cè)。具體研究?jī)?nèi)容如下:1、基于Au@Pt納米酶ELISA/H₂O₂→O₂↑/SDS免疫夾心泡沫法定性/量快速檢測(cè)E.coli O157:H7本章通過(guò)將泡沫生成反應(yīng)指示系統(tǒng)與病原體識(shí)別組分相結(jié)合,利用低成本的測(cè)量工具-直尺直接測(cè)量泡沫高度的變化,研發(fā)了一種泡沫免疫分析技術(shù),可同時(shí)實(shí)現(xiàn)定性定量檢測(cè)E.coli O157:H7。用修飾了鼠抗E.coli O157... 

【文章來(lái)源】：浙江工商大學(xué)浙江省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

過(guò)氧化氫酶與PtNPs表觀周轉(zhuǎn)數(shù)（kcat）比較

21細(xì)菌濃度，菌落單位為CFU·mL-1。經(jīng)過(guò)兩次活化的培養(yǎng)物4C下以6000rpm離心10min，用5mL含0.5%甲醛的生理鹽水作為滅活細(xì)菌制劑，37C下滅活上述細(xì)菌懸浮液12h，這確保了實(shí)驗(yàn)室人員的人身安全。隨后將其離心并重新分散在5mL生理鹽水中，并儲(chǔ)存在4°C環(huán)境下。通過(guò)滅活細(xì)菌細(xì)胞來(lái)評(píng)估所開(kāi)發(fā)的泡沫免疫測(cè)定的條件和性能。同樣地，用C.sakazakii，C.freundii，L.monocytogenes，S.putrefaciens，B.subtilis和B.cereus用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)。2.1.7免疫夾心泡沫法實(shí)驗(yàn)流程圖2.1制備（A）Au@PtNP，（B）mAb2-Au@Pt/SiO2NP，（C）夾心免疫反應(yīng)檢測(cè)E.coliO157:H7和（D）泡沫法快速定量檢測(cè)E.coliO157:H7的工作原理圖Fig.2.1Aschematicillustrationofthefabricationprocessof(A)Au@PtNP,(B)mAb2-Au@Pt/SiO2NP,(C)sandwichimmunereactionfordetectionofE.coliO157:H7usingMIcsand(D)mAb2-Au@Pt/SiO2NPandworkingprincipleoffoamimmunoassayforrapidandquantitativedetectionofE.coliO157:H7免疫夾心泡沫法測(cè)定過(guò)程見(jiàn)圖2.1C和圖2.1D。首先，將30μLMIc（10mg·mL-1）與3mLE.coliO157:H7選擇性增菌液混合，并在37C溫和振蕩下孵育30min，然后將復(fù)合物用PBST洗滌3次，加入5μLmAb2-Au@Pt/SiO2NP并在37C下再孵育30min。

22同樣的，將復(fù)合物用PBST洗滌3次并用磁鐵分離，然后用50μLPBS重懸后，將夾心復(fù)合物轉(zhuǎn)移到96孔板中。將60μL30%H2O2溶液和50μL16mmol·mL-1SDS加入到孔中，迅速用硅膠塞密封，立即插入亞克力細(xì)管。在室溫下反應(yīng)25min后，用尺子測(cè)量亞克力細(xì)管中O2與SDS所形成泡沫的高度，所有數(shù)據(jù)均通過(guò)3次平行測(cè)量分析獲得。2.2結(jié)果和討論2.2.1免疫夾心泡沫法的原理免疫夾心泡沫法的檢測(cè)原理如圖2.1所示，定量檢測(cè)只用了96孔板，硅膠塞和亞克力細(xì)管。具體裝置如圖2.1D所示，用硅膠塞密封孔，然后插入亞克力細(xì)管。該夾心型泡沫免疫測(cè)定法由MIc選擇性富集和分離待測(cè)菌，并與mAb2-Au@Pt/SiO2NP結(jié)合形成夾心免疫結(jié)構(gòu)。Au@PtNP具有將H2O2分解成H2O和O2的優(yōu)異催化能力，產(chǎn)生的O2被表面活性劑SDS捕獲并轉(zhuǎn)化為泡沫，繼而通過(guò)壓力將泡沫推進(jìn)亞克力細(xì)管中，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)并方便測(cè)量的高度變化。泡沫的高度與待測(cè)目的菌E.coliO157:H7的濃度直接相關(guān)，通過(guò)測(cè)量泡沫的高度來(lái)實(shí)現(xiàn)定性定量檢測(cè)目標(biāo)物的濃度。2.2.2MNP和Au@Pt/SiO2NP的表征圖2.2（A）磁珠的透射電鏡圖；（B）磁珠的紅外光譜圖Fig.2.2(A)TheTEMimageofMNP;(B)TheFTIRspectraofMNP

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基于實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)雞肉中的大腸桿菌O157:H[J]. 趙遠(yuǎn)洋,王瑾,林麗萍,郜彥彥,吳國(guó)平.  中國(guó)食品學(xué)報(bào). 2019(03)
[2]乳膠凝集試驗(yàn)快速檢測(cè)腸出血性大腸桿菌O157∶H7的研究[J]. 羅玲,羅青平,溫國(guó)元,王紅琳,汪宏才,張騰飛,艾地云,盧琴,張蓉蓉,邵華斌.  中國(guó)家禽. 2017(06)
[3]免疫磁分離結(jié)合膠體金免疫層析法快速檢測(cè)大腸桿菌O157:H7[J]. 顧培科.  大家健康(學(xué)術(shù)版). 2015(02)
[4]生物傳感器檢測(cè)食源性大腸桿菌O157:H7研究新進(jìn)展[J]. 劉慧玲,呂敬章,朱智壕,范放,張恒.  食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào). 2013(06)
[5]食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 封莉,黃繼超,劉欣,黃明,周光宏.  食品科學(xué). 2012(21)
[6]基于甘露糖功能化的水凝膠用于E.coli O157:H7的檢測(cè)[J]. 周麗霞,何定庚,何曉曉,卿志和,王柯敏,曹杰.  高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報(bào). 2012(04)
[7]新型層析快速檢測(cè)技術(shù)及其在食品安全中的應(yīng)用[J]. 劉道峰,鄧省亮,賴衛(wèi)華.  食品與機(jī)械. 2011(06)
[8]一個(gè)新的測(cè)定Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH及清除的熒光方法[J]. 谷學(xué)新,邰超,鄒洪,郭啟華.  分析科學(xué)學(xué)報(bào). 2002(06)
[9]水楊基熒光酮熒光法測(cè)定鈷Ⅱ-過(guò)氧化氫體系產(chǎn)生的羥自由基[J]. 任鳳蓮,吳南,司士輝.  分析化學(xué). 2001(01)

博士論文
[1]快速檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中大腸桿菌O157：H7的生物傳感方法與儀器研究[D]. 王一嫻.浙江大學(xué) 2013



本文編號(hào)：3460097