發(fā)布時間：2021-10-25 23:59

　　SlHB8屬于HD-ZipⅢ轉(zhuǎn)錄因子家族,通過分析番茄已有的RNA-seq數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)SlHB8可能對單性結(jié)實(shí)的形成具有一定的調(diào)控作用。為了研究SlHB8對番茄單性結(jié)實(shí)形成的生物學(xué)功能,本研究利用Gateway克隆技術(shù),通過SlHB8的同義突變SlHB8Ris的miR165/166識別位點(diǎn)來構(gòu)建該基因的植物超表達(dá)載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對番茄進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,PCR檢測鑒定陽性轉(zhuǎn)化植株,對T0代陽性植株進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)量分析,結(jié)果表明陽性轉(zhuǎn)化植株中SlHB8基因的表達(dá)量均有不同程度的提高,從而為闡明SlHB8基因的生物學(xué)功能提供了一定的理論參考。 

【文章來源】：分子植物育種. 2020,18(05)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

SlH B8Ris基因的克隆及過表達(dá)載體的構(gòu)建

通過分析單性結(jié)實(shí)突變體pat的RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在pat子房發(fā)育過程中HD-ZipⅢ家族成員中只有SlHB8基因的表達(dá)量發(fā)生了顯著變化，并且SlHB8基因的表達(dá)依賴于授粉受精(pollination-dependent gene)，與野生型相比SlHB8在pat盛開花子房中的表達(dá)量升高了2～3倍(圖1A)。另外一組RNA-Seq數(shù)據(jù)表明SlHB8可以被生長素、赤霉素以及授粉受精誘導(dǎo)表達(dá)，在生長素、赤霉素誘導(dǎo)坐果的單性結(jié)實(shí)番茄子房中以及人工授粉誘導(dǎo)坐果的番茄子房中SlHB8的表達(dá)量升高了2～3倍，而沒有成功坐果的番茄子房中SlHB8的表達(dá)量是未處理子房中SlHB8表達(dá)量的0.622倍(圖1B)，推測該基因?qū)Ψ炎哂兄匾恼{(diào)節(jié)作用。1.2 SlHB8基因的克隆及植物超表達(dá)載體的構(gòu)建

HD-ZipⅢ家族成員被miR165/166轉(zhuǎn)錄后調(diào)控(Hu et al.,2014)。因此，通過SlHB8的同義突變SlH-BRis的miR165/166識別位點(diǎn)來構(gòu)建該基因的植物超表達(dá)載體(圖2)。從番茄的數(shù)據(jù)庫(https://solgenomics.net/)中獲取番茄SlHB8的全長序列，根據(jù)miR165/166識別位點(diǎn)設(shè)計(jì)前后引物，利用重疊PCR的原理獲得突變的SlHB8全長序列，將獲得產(chǎn)物經(jīng)過電泳驗(yàn)證(圖3A)，并命名為SlHB8Ris。取適量產(chǎn)物通過BP酶重組反應(yīng)，重組至入門載體上pDonor 207，經(jīng)慶大霉素篩選后，挑取單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行檢測(圖3B)，電泳結(jié)果顯示產(chǎn)物與目的片段大小相一致。挑選克隆送擎科生物公司測序。結(jié)果驗(yàn)證序列與SlHB8Ris序列一致，說明基因SlHB8Ris已成功重組至入門載體上。入門載體與植物超表達(dá)載體pMDC32在LR重組酶的作用下進(jìn)行重組反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，經(jīng)卡那霉素篩選后挑取單克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行檢測(圖3C)，結(jié)果表明，目的片段與預(yù)期的相一致，目的片段已經(jīng)成功重組到植物超表達(dá)載體pMDC32中，即SlHB8植物過表達(dá)載體(pMDC32-Sl HB8Ris)已構(gòu)建成功。1.3 SlHB8Ris過表達(dá)番茄植株的獲得和陽性鑒定

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]番茄營養(yǎng)成分以及國內(nèi)外加工現(xiàn)狀[J]. 趙美佳,鄒通,湯澤君,李存香.  食品研究與開發(fā). 2016(10)
[2]單性結(jié)實(shí)櫻桃番茄新品種浙櫻粉1號的選育[J]. 阮美穎,周國治,葉青靜,李志邈,王榮青,姚祝平,萬紅建,楊悅儉.  中國蔬菜. 2016(02)
[3]番茄單性結(jié)實(shí)研究進(jìn)展[J]. 張少麗,邵景成,胡志峰,魏兵強(qiáng).  園藝學(xué)報(bào). 2016(01)
[4]單性結(jié)實(shí)的分子研究進(jìn)展[J]. 涂冬萍,馬小軍,莫長明,潘麗梅,馮世鑫,黃杰.  中草藥. 2014(20)
[5]植物果實(shí)發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 蔣勵,張小蘭.  中國蔬菜. 2013(06)
[6]用單性結(jié)實(shí)基因defH9-iaaM轉(zhuǎn)化糖橙的研究[J]. 羅賽男,鄧子牛,鐘曉紅,張家銀,袁飛榮,楊莉.  湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2008(02)
[7]番茄ps-2雄性不育品系的初步觀察[J]. 李君明,Bistra Atanassova,徐和金,周永健,楊寶軍.  園藝學(xué)報(bào). 2002(04)



本文編號：3458421