玉米籽粒作為主要的儲能部位是玉米產(chǎn)量形成的基礎,玉米籽粒發(fā)育機理的研究有助于玉米產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的遺傳改良。線粒體是植物細胞的能量工廠和進行有氧呼吸的主要場所,電子傳遞鏈是線粒體的產(chǎn)能核心,需要適當組裝呼吸鏈復合物I-V才能發(fā)揮其功能,NADH脫氫酶4（nad4）基因編碼線粒體呼吸鏈復合物I亞基IV。植物線粒體內(nèi)含子為II型內(nèi)含子,在翻譯前需要剪接。PPR蛋白是細胞核編碼的,參與細胞器基因表達的調(diào)控因子,包括細胞器RNA的編輯、內(nèi)含子剪接、轉錄以及穩(wěn)定性,其中P類PPR蛋白主要參與細胞器mRNA的剪接過程。本研究以玉米籽粒發(fā)育缺陷突變體defective kernel 43（dek43）為研究材料。dek43突變體表現(xiàn)出籽粒變小,粒重降低,胚胎致死,種皮顏色變淺等表型。組織切片分析發(fā)現(xiàn),與同時期野生型相比,突變體籽粒胚和胚乳發(fā)育明顯滯后,胚乳淀粉積累減少,且胚乳中部出現(xiàn)空腔。我們通過圖位克隆技術去鑒定突變基因,在F₂代分離群體中共篩選了938個突變籽粒,通過12個分子標記,將基因定位在約900 Kb的區(qū)間內(nèi),該區(qū)間有28個基因,通過測序發(fā)現(xiàn)Zm00001d02105... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
縮略詞說明
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 玉米籽粒的結構
        1.1.1 玉米籽粒的發(fā)育
        1.1.2 玉米胚的發(fā)育
        1.1.3 玉米胚乳的發(fā)育
        1.1.4 玉米dek籽粒突變體
    1.2 高等植物線粒體
        1.2.1 線粒體和氧化呼吸鏈
        1.2.2 線粒體是半自主細胞器
        1.2.3 線粒體內(nèi)含子
        1.2.4 線粒體RNA的轉錄后修飾
    1.3 PPR蛋白家族
        1.3.1 PPR蛋白家族分布與進化
        1.3.2 PPR蛋白家族的分類
        1.3.3 PPR蛋白家族的功能
        1.3.4 PLS類 PPR蛋白的功能
        1.3.5 P類 PPR蛋白的功能
            1.3.5.1 線粒體P類 PPR蛋白促進RNA剪接
    1.4 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 玉米自交系材料
        2.1.2 菌株和質(zhì)粒載體
        2.1.3 酶與生化試劑
        2.1.4 引物合成與測序
        2.1.5 培養(yǎng)基
    2.2 實驗方法
        2.2.1 玉米材料種植與生長環(huán)境
        2.2.2 體視鏡觀察
        2.2.3 石蠟切片觀察
        2.2.4 透射電鏡觀察
        2.2.5 玉米基因組DNA提取方法
            2.2.5.1 CTAB法提取玉米葉片基因組DNA
            2.2.5.2 CTAB法提取玉米籽�；蚪MDNA
        2.2.6 PCR篩選多態(tài)性SSR分子標記
        2.2.7 PCR產(chǎn)物的檢測
            2.2.7.1 50 ×TAE電泳母液配制
            2.2.7.2 4 %瓊脂糖凝膠的配制及PCR產(chǎn)物的檢測
        2.2.8 SSR分子標記的開發(fā)
        2.2.9 PCR擴增候選基因序列
        2.2.10 目的片段膠回收
        2.2.11 克隆載體的構建
        2.2.12 大腸桿菌感受態(tài)制備
        2.2.13 熱激法轉化大腸桿菌
        2.2.14 大腸桿菌的活化
        2.2.15 大腸桿菌菌落PCR鑒定
        2.2.16 DNA測序
        2.2.17 玉米總RNA的提取
            2.2.17.1 玉米籽粒總RNA的提取(CTAB法)
            2.2.17.2 玉米葉片總RNA的提取(Trizol法)
        2.2.18 反轉錄c DNA第一條鏈的合成
        2.2.19 實時熒光定量PCR
        2.2.20 半定量PCR
        2.2.21 亞細胞定位
            2.2.21.1 質(zhì)粒大量提取純化
            2.2.21.2 原生質(zhì)體制備
        2.2.22 Western Blot檢測
        2.2.23 線粒體復合物分析
            2.2.23.1 線粒體復合物提取
            2.2.23.2 線粒體復合物豐度分析
            2.2.23.3 線粒體復合物I活性分析
        2.2.24 序列連鎖性分析
            2.2.24.1 CTAB法提取玉米籽�；蚪MDNA
            2.2.24.2 突變位點PCR擴增
            2.2.24.3 電泳檢測及測序
            2.2.24.4 序列連鎖性分析
        2.2.25 等位雜交實驗
3 結果與分析
    3.1 dek43 突變體表型分析
    3.2 遺傳鑒定
    3.3 不同發(fā)育時期籽粒組織切片觀察
    3.4 Dek43 的圖位克隆
        3.4.1 多態(tài)性SSR分子標記的篩選
        3.4.2 Dek43 的初定位
        3.4.3 Dek43 的精細定位
    3.5 目的基因的確認
    3.6 Dek43 基因功能分析
        3.6.1 Dek43 基因的蛋白結構和表達模式
        3.6.2 DEK43 蛋白定位于細胞核和線粒體
        3.6.3 dek43 突變體中nad4 轉錄本第一個內(nèi)含子和第三個內(nèi)含子剪接效率下降
        3.6.4 dek43 突變體中呼吸鏈復合體I含量下降
        3.6.5 dek43 突變體透射電鏡觀察
        3.6.6 dek43 突變體中交替氧化呼吸途徑相關基因表達量上升
        3.6.7 dek43 突變體轉錄組分析
4 討論
    4.1 玉米DEK43 是一個定位于細胞核和線粒體的P類 PPR蛋白特異性參與了nad4 基因的剪接
    4.2 nad4 基因轉錄后加工對線粒體功能維持非常重要
    4.3 線粒體功能缺失顯著影響籽粒發(fā)育
5 結論
參考文獻
附錄
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的論文及成果


【參考文獻】：
期刊論文
[1]玉米胚乳發(fā)育研究進展[J]. 王曉燕,高榮岐,董樹亭.  中國農(nóng)學通報. 2005(06)
[2]玉米胚胎發(fā)育研究[J]. 洪宗憲,金惠芬,茍三啟.  甘肅農(nóng)業(yè)科技. 1983(03)

碩士論文
[1]植物PPR基因家族的鑒定與進化分析[D]. 宋學花.華南理工大學 2017



本文編號：3431247