玉米籽粒作為主要的儲(chǔ)能部位是玉米產(chǎn)量形成的基礎(chǔ),玉米籽粒發(fā)育機(jī)理的研究有助于玉米產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的遺傳改良。線粒體是植物細(xì)胞的能量工廠和進(jìn)行有氧呼吸的主要場所,電子傳遞鏈?zhǔn)蔷�粒體的產(chǎn)能核心,需要適當(dāng)組裝呼吸鏈復(fù)合物I-V才能發(fā)揮其功能,NADH脫氫酶4（nad4）基因編碼線粒體呼吸鏈復(fù)合物I亞基IV。植物線粒體內(nèi)含子為II型內(nèi)含子,在翻譯前需要剪接。PPR蛋白是細(xì)胞核編碼的,參與細(xì)胞器基因表達(dá)的調(diào)控因子,包括細(xì)胞器RNA的編輯、內(nèi)含子剪接、轉(zhuǎn)錄以及穩(wěn)定性,其中P類PPR蛋白主要參與細(xì)胞器mRNA的剪接過程。本研究以玉米籽粒發(fā)育缺陷突變體defective kernel 43（dek43）為研究材料。dek43突變體表現(xiàn)出籽粒變小,粒重降低,胚胎致死,種皮顏色變淺等表型。組織切片分析發(fā)現(xiàn),與同時(shí)期野生型相比,突變體籽粒胚和胚乳發(fā)育明顯滯后,胚乳淀粉積累減少,且胚乳中部出現(xiàn)空腔。我們通過圖位克隆技術(shù)去鑒定突變基因,在F₂代分離群體中共篩選了938個(gè)突變籽粒,通過12個(gè)分子標(biāo)記,將基因定位在約900 Kb的區(qū)間內(nèi),該區(qū)間有28個(gè)基因,通過測序發(fā)現(xiàn)Zm00001d02105... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
縮略詞說明
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 玉米籽粒的結(jié)構(gòu)
        1.1.1 玉米籽粒的發(fā)育
        1.1.2 玉米胚的發(fā)育
        1.1.3 玉米胚乳的發(fā)育
        1.1.4 玉米dek籽粒突變體
    1.2 高等植物線粒體
        1.2.1 線粒體和氧化呼吸鏈
        1.2.2 線粒體是半自主細(xì)胞器
        1.2.3 線粒體內(nèi)含子
        1.2.4 線粒體RNA的轉(zhuǎn)錄后修飾
    1.3 PPR蛋白家族
        1.3.1 PPR蛋白家族分布與進(jìn)化
        1.3.2 PPR蛋白家族的分類
        1.3.3 PPR蛋白家族的功能
        1.3.4 PLS類 PPR蛋白的功能
        1.3.5 P類 PPR蛋白的功能
            1.3.5.1 線粒體P類 PPR蛋白促進(jìn)RNA剪接
    1.4 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 玉米自交系材料
        2.1.2 菌株和質(zhì)粒載體
        2.1.3 酶與生化試劑
        2.1.4 引物合成與測序
        2.1.5 培養(yǎng)基
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 玉米材料種植與生長環(huán)境
        2.2.2 體視鏡觀察
        2.2.3 石蠟切片觀察
        2.2.4 透射電鏡觀察
        2.2.5 玉米基因組DNA提取方法
            2.2.5.1 CTAB法提取玉米葉片基因組DNA
            2.2.5.2 CTAB法提取玉米籽�；蚪MDNA
        2.2.6 PCR篩選多態(tài)性SSR分子標(biāo)記
        2.2.7 PCR產(chǎn)物的檢測
            2.2.7.1 50 ×TAE電泳母液配制
            2.2.7.2 4 %瓊脂糖凝膠的配制及PCR產(chǎn)物的檢測
        2.2.8 SSR分子標(biāo)記的開發(fā)
        2.2.9 PCR擴(kuò)增候選基因序列
        2.2.10 目的片段膠回收
        2.2.11 克隆載體的構(gòu)建
        2.2.12 大腸桿菌感受態(tài)制備
        2.2.13 熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌
        2.2.14 大腸桿菌的活化
        2.2.15 大腸桿菌菌落PCR鑒定
        2.2.16 DNA測序
        2.2.17 玉米總RNA的提取
            2.2.17.1 玉米籽粒總RNA的提取(CTAB法)
            2.2.17.2 玉米葉片總RNA的提取(Trizol法)
        2.2.18 反轉(zhuǎn)錄c DNA第一條鏈的合成
        2.2.19 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        2.2.20 半定量PCR
        2.2.21 亞細(xì)胞定位
            2.2.21.1 質(zhì)粒大量提取純化
            2.2.21.2 原生質(zhì)體制備
        2.2.22 Western Blot檢測
        2.2.23 線粒體復(fù)合物分析
            2.2.23.1 線粒體復(fù)合物提取
            2.2.23.2 線粒體復(fù)合物豐度分析
            2.2.23.3 線粒體復(fù)合物I活性分析
        2.2.24 序列連鎖性分析
            2.2.24.1 CTAB法提取玉米籽�；蚪MDNA
            2.2.24.2 突變位點(diǎn)PCR擴(kuò)增
            2.2.24.3 電泳檢測及測序
            2.2.24.4 序列連鎖性分析
        2.2.25 等位雜交實(shí)驗(yàn)
3 結(jié)果與分析
    3.1 dek43 突變體表型分析
    3.2 遺傳鑒定
    3.3 不同發(fā)育時(shí)期籽粒組織切片觀察
    3.4 Dek43 的圖位克隆
        3.4.1 多態(tài)性SSR分子標(biāo)記的篩選
        3.4.2 Dek43 的初定位
        3.4.3 Dek43 的精細(xì)定位
    3.5 目的基因的確認(rèn)
    3.6 Dek43 基因功能分析
        3.6.1 Dek43 基因的蛋白結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式
        3.6.2 DEK43 蛋白定位于細(xì)胞核和線粒體
        3.6.3 dek43 突變體中nad4 轉(zhuǎn)錄本第一個(gè)內(nèi)含子和第三個(gè)內(nèi)含子剪接效率下降
        3.6.4 dek43 突變體中呼吸鏈復(fù)合體I含量下降
        3.6.5 dek43 突變體透射電鏡觀察
        3.6.6 dek43 突變體中交替氧化呼吸途徑相關(guān)基因表達(dá)量上升
        3.6.7 dek43 突變體轉(zhuǎn)錄組分析
4 討論
    4.1 玉米DEK43 是一個(gè)定位于細(xì)胞核和線粒體的P類 PPR蛋白特異性參與了nad4 基因的剪接
    4.2 nad4 基因轉(zhuǎn)錄后加工對(duì)線粒體功能維持非常重要
    4.3 線粒體功能缺失顯著影響籽粒發(fā)育
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文及成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]玉米胚乳發(fā)育研究進(jìn)展[J]. 王曉燕,高榮岐,董樹亭.  中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2005(06)
[2]玉米胚胎發(fā)育研究[J]. 洪宗憲,金惠芬,茍三啟.  甘肅農(nóng)業(yè)科技. 1983(03)

碩士論文
[1]植物PPR基因家族的鑒定與進(jìn)化分析[D]. 宋學(xué)花.華南理工大學(xué) 2017



本文編號(hào)：3431247