目的:人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）在人群中普遍感染,具有潛伏-激活的感染特點(diǎn)。易在新生兒、器官移植及HIV等免疫力低下患者內(nèi)激活引起嚴(yán)重并發(fā)癥和后遺癥,甚至造成死亡。HCMV具有嚴(yán)格的種屬特異性,僅感染人,沒有良好的動物模型,對潛伏激活的研究常通過細(xì)胞模型。本研究通過建立神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G的HCMV潛伏再激活模型,收集潛伏和激活狀態(tài)不同時(shí)間點(diǎn)的感染細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測序。分析潛伏和激活感染狀態(tài)轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因。探討基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制在HCMV感染再激活過程中的作用。為進(jìn)一步探討HCMV潛伏再激活機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法:1.建立HCMV感染T98G細(xì)胞潛伏模型:T98G細(xì)胞采用無血清饑餓法饑餓78h后,鋪于150mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中（2×10⁶cells/dish）,2小時(shí)內(nèi)待細(xì)胞貼壁后以感染復(fù)數(shù)為10感染HCMV實(shí)驗(yàn)株Towne BAC,感染后16小時(shí)用PBS清洗一次并更換為全新的培養(yǎng)基。培養(yǎng)7天進(jìn)行傳代,傳代過程中收集每代的細(xì)胞樣品檢測病毒基因組拷貝數(shù)及相關(guān)基因的RNA轉(zhuǎn)錄水平,收集... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

cDNA文庫構(gòu)建過程

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文14圖2.2HISAT比對參考基因組示意圖2.2.7驗(yàn)證CEBPD在病毒激活中的作用2.2.7.1CEBPD測序結(jié)果驗(yàn)證（1）qPCR檢測CEBPD的RNA水平設(shè)計(jì)引物檢測測序樣品的CEBPD的RNA表達(dá)，引物及具體方法見上。（2）Westernblot檢測CEBPD的蛋白表達(dá)水平對測序樣品采用westernblot方法檢測CEBPD的蛋白表達(dá)，抗體見上，詳細(xì)方法見下。2.2.7.2應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)CEBPD的表達(dá)HCMV感染的T98G細(xì)胞傳代到建立潛伏時(shí)即PX代細(xì)胞，在PX代細(xì)胞長滿單層的第7天消化后鋪于六孔板中（3×105/孔），第二天轉(zhuǎn)染CEBPD-siRNA

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文183實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1建立HCMV在T98G細(xì)胞中的潛伏感染模型HCMV以MOI=10感染T98G細(xì)胞，每7天傳代一次，觀察發(fā)現(xiàn)HCMV感染T98G細(xì)胞第7天（P0代），細(xì)胞中GFP信號不足50%，隨著傳代，細(xì)胞中的GFP信號不斷減少，至P7代時(shí)大部分視野均無GFP信號，偶在一個(gè)視野可見散在一兩個(gè)GFP信號。收集每代T98G細(xì)胞的上清接種到HFF細(xì)胞中培養(yǎng)14天觀察發(fā)現(xiàn)P4代之前的上清接種的HFF細(xì)胞中均有明顯的GFP信號，隨著傳代GFP信號不斷減少，至P7代上清接種的HFF細(xì)胞中未觀察到綠色熒光（圖3.1）。上清中病毒滴度檢測結(jié)果表明P0代上清中病毒滴度高達(dá)300PFU/ml，P7代上清中空斑計(jì)數(shù)為0，未檢出到感染性病毒顆粒（圖3.2）。圖3.1T98G細(xì)胞及上清中HCMV感染結(jié)果圖3.2T98G培養(yǎng)上清病毒滴度結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]人巨細(xì)胞病毒感染促動脈粥樣硬化的機(jī)制[J]. 申廣輝,曹麗娟,陳福祥.  國際心血管病雜志. 2017(05)
[2]人巨細(xì)胞病毒潛伏感染機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 高慧慧,陶然,俞惠民,尚世強(qiáng).  病毒學(xué)報(bào). 2016(01)



本文編號：3429994