文中構(gòu)建了miR-22重組腺病毒Ad-miR-22,分析了其對HepG2細(xì)胞胰島素信號通路及葡萄糖攝取的抑制作用。通過PCR方法,擴增了miR-22的前體及側(cè)翼序列,酶切后克隆至腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV中,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pAdT-22,經(jīng)PCR及測序鑒定。穿梭質(zhì)粒經(jīng)PmeⅠ線性化后,直接轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架載體的感受態(tài)細(xì)胞BJ5183,產(chǎn)生重組腺病毒質(zhì)粒Ad-miR-22,最后經(jīng)PacⅠ線性化后轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系293A。重組腺病毒經(jīng)過3輪擴增后感染HepG2細(xì)胞,通過熒光定量PCR檢測miR-22表達(dá)水平。通過葡萄糖攝取實驗觀察Ad-miR-22對HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取的影響。采用Western blotting檢測Ad-miR-22對HepG2細(xì)胞SIRT1在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)及GSK-3β磷酸化水平的影響。采用熒光定量PCR檢測miR-22對PEPCK及G6Pase等基因在mRNA水平表達(dá)的影響。結(jié)果表明,重組腺病毒Ad-miR-22感染顯著增加HepG2細(xì)胞miR-22表達(dá)水平。此外,Ad-miR-22顯著抑制胰島素誘導(dǎo)的HepG2葡萄糖攝取,并通過下調(diào)GSK-3β磷酸化... 

【文章來源】：生物工程學(xué)報. 2020,36(04)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：9 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料及試劑
    1.2 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞
    1.3 穿梭質(zhì)粒及重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建
    1.4 重組腺病毒的包裝和擴增
    1.5 熒光定量PCR
    1.6 葡萄糖攝取檢測
    1.7 細(xì)胞糖原含量檢測
    1.8 Western blotting
2 結(jié)果與分析
    2.1 構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdT-22
    2.2 構(gòu)建重組腺病毒過表達(dá)載體
    2.3 重組腺病毒顆粒的產(chǎn)生及大量擴增
    2.4 miR-22在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)分析
    2.5 miR-22對肝細(xì)胞糖異生及葡萄糖攝取的抑制
    2.6 miR-22對肝細(xì)胞糖原合成的抑制
    2.7 miR-22對GSK-3β磷酸化及SIRT1蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制
3 討論



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