目的:構建miR-338-3p過表達/抑制表達慢病毒載體,并檢測其感染效率。方法:由miRBase數據庫查找獲得miR-338-3p前體序列,設計目的基因片段并人工合成;將miR-338-3p前體序列分別和p LVX-ZsGreen-miRNAPuro/p LVX-shRNA2-Puro載體進行雙酶切反應后連接產生p LVX-ZsGreen-mmu-miR-338-Puro/p LVX-shRNA2-PuromiR-338-3p inhibitor慢病毒表達載體,測序鑒定,篩選陽性克隆。并感染293T細胞,包裝產生慢病毒并測定滴度。通過熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測過表達/抑制表達miR-338-3p慢病毒感染RAW264. 7效率。結果:經過雙酶切反應鑒定和測序證實,成功構建了miR-338-3p的慢病毒過表達/抑制表達載體p LVX-ZsGreen-mmu-miR-338-Puro/p LVX-shRNA2-Puro-miR-338-3p inhibitor,熒光顯微鏡下觀察可見包裝細胞293T表達綠色熒光。熒光顯微鏡及流式細胞檢測技術提示,感染RAW264. 7破骨細胞系可獲得穩(wěn)定且... 

【文章來源】：臨床口腔醫(yī)學雜志. 2020,36(02)

【文章頁數】：4 頁

【部分圖文】：

過表達/抑制表達載體質粒圖譜

將含有目的基因的重組質粒p LVX-ZsGreen-mmu-miR-338-Puro、p LVX-shRNA2-Puro-miR-338-3p inhibitor分別導入293T細胞，產生含有目的基因的高滴度慢病毒。轉染24 h后分別用熒光顯微鏡和倒置顯微鏡觀察并拍照，結果發(fā)現(xiàn)有約80%的細胞可自發(fā)熒光(圖2)，表明轉染效果良好。48 h后收集病毒，利用倍比稀釋法測定包裝的兩種病毒滴度，測得病毒滴度分別為3×108TU/m L,4×108TU/m L。2在RAW264.7細胞中有良好的感染效果

為了檢測病毒在RAW264.7破骨細胞中的感染效果，將已包裝好的過表達/干擾慢病毒轉導入RAW264.7細胞中。48 h后采用熒光顯微鏡觀察帶綠色熒光信號的細胞，并拍照記錄(圖3)。圖3 熒光顯微鏡下觀察病毒感染RAW264.7細胞圖(×100)

【參考文獻】：
期刊論文
[1]慢病毒載體及其應用進展[J]. 褚波,黃雪峰,唐云明.  生物醫(yī)學工程學雜志. 2008(01)



本文編號：3423019