目的:構(gòu)建miR-338-3p過表達(dá)/抑制表達(dá)慢病毒載體,并檢測其感染效率。方法:由miRBase數(shù)據(jù)庫查找獲得miR-338-3p前體序列,設(shè)計(jì)目的基因片段并人工合成;將miR-338-3p前體序列分別和p LVX-ZsGreen-miRNAPuro/p LVX-shRNA2-Puro載體進(jìn)行雙酶切反應(yīng)后連接產(chǎn)生p LVX-ZsGreen-mmu-miR-338-Puro/p LVX-shRNA2-PuromiR-338-3p inhibitor慢病毒表達(dá)載體,測序鑒定,篩選陽性克隆。并感染293T細(xì)胞,包裝產(chǎn)生慢病毒并測定滴度。通過熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測過表達(dá)/抑制表達(dá)miR-338-3p慢病毒感染RAW264. 7效率。結(jié)果:經(jīng)過雙酶切反應(yīng)鑒定和測序證實(shí),成功構(gòu)建了miR-338-3p的慢病毒過表達(dá)/抑制表達(dá)載體p LVX-ZsGreen-mmu-miR-338-Puro/p LVX-shRNA2-Puro-miR-338-3p inhibitor,熒光顯微鏡下觀察可見包裝細(xì)胞293T表達(dá)綠色熒光。熒光顯微鏡及流式細(xì)胞檢測技術(shù)提示,感染RAW264. 7破骨細(xì)胞系可獲得穩(wěn)定且... 

【文章來源】：臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志. 2020,36(02)

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

過表達(dá)/抑制表達(dá)載體質(zhì)粒圖譜

將含有目的基因的重組質(zhì)粒p LVX-ZsGreen-mmu-miR-338-Puro、p LVX-shRNA2-Puro-miR-338-3p inhibitor分別導(dǎo)入293T細(xì)胞，產(chǎn)生含有目的基因的高滴度慢病毒。轉(zhuǎn)染24 h后分別用熒光顯微鏡和倒置顯微鏡觀察并拍照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有約80%的細(xì)胞可自發(fā)熒光(圖2)，表明轉(zhuǎn)染效果良好。48 h后收集病毒，利用倍比稀釋法測定包裝的兩種病毒滴度，測得病毒滴度分別為3×108TU/m L,4×108TU/m L。2在RAW264.7細(xì)胞中有良好的感染效果

為了檢測病毒在RAW264.7破骨細(xì)胞中的感染效果，將已包裝好的過表達(dá)/干擾慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入RAW264.7細(xì)胞中。48 h后采用熒光顯微鏡觀察帶綠色熒光信號的細(xì)胞，并拍照記錄(圖3)。圖3 熒光顯微鏡下觀察病毒感染RAW264.7細(xì)胞圖(×100)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]慢病毒載體及其應(yīng)用進(jìn)展[J]. 褚波,黃雪峰,唐云明.  生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志. 2008(01)



本文編號：3423019