發(fā)布時間：2021-09-24 21:55

　　納米抗體是由駱駝科或軟骨魚體內(nèi)僅由重鏈組成的特殊抗體的可變區(qū)克隆得到的最小的蛋白質(zhì)功能域,應用前景十分寬廣。本課題首先探究了駱駝源樣本RNA的提取方法,并對其提取條件進行了優(yōu)化;利用優(yōu)化后的方法獲取了 20峰雙峰駝外周血淋巴細胞和1峰雙峰駝脾臟細胞RNA,經(jīng)cDNA反轉(zhuǎn)、擴增、連接噬菌體,電轉(zhuǎn)化等步驟構(gòu)建了 4個駝源天然納米抗體庫,采用固體菌落計數(shù)法和高通量測序技術(shù)對四個文庫的庫容量和多樣性進行了鑒定。結(jié)果如下。1.RNA提取優(yōu)化實驗的結(jié)果顯示,兩種提取方法得到的RNA的A260/A280值和A260/A230值的數(shù)據(jù)均處于正常值區(qū)間;RNA的得率方面,沉淀法優(yōu)于硅基膜法,是其2倍以上;RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)硅基膜法提取的RNA可見目的條帶。2.噬菌體展示文庫實驗結(jié)果顯示,成功構(gòu)建了 CNL1、CNL2、CNL3和CNL4四個抗體文庫,且?guī)烊萘烤^好,分別為4.21× 109、4.10×109、1.74×109和4.10×109。經(jīng)隨機克隆抽樣驗證插入率,表明四個抗體庫的插入率均為100%。3.高通量測序數(shù)據(jù)顯示唯一序列與非唯一序列的比例分別為87.70%、89.22%、89.84%和8... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１技術(shù)路線圖??Ｆｉｇ．?１?Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?ｒｏａｄ?ｍａｐ??

８３．００ａ±４８．５７?１?３５３．００ｂ±８６．６０?０．１２?０．０６?２．００??８０?３?０２３．００＾：１７６．７０?１?１２５．００ｂ±３３．２８?０．１１?０．０４?２．７５??注：得率：濃度Ｘ體積／脾臟用量（體積３０．０?ｎＬ）；同一行上標相同字母代表差異不顯著（尸＞０．０５），不同字母??代表差異顯著（ｐ＜〇．〇５）。??為了更直觀的探宄ＴＲＩｚｏｌ試劑用量與脾臟組織用量對兩種方法提取總ＲＮＡ濃??度的影響，根據(jù)脾臟組織用量與最終的ＲＮＡ提取濃度數(shù)據(jù)，作了如圖２所示的擬??合曲線。圖２顯示，隨著脾臟量的增加，無論沉淀法還是硅基膜法均呈現(xiàn)上升的趨??勢，且沉淀法比硅基膜法上升較快；沉淀法的擬合方程為Ｙ＝３９．７２３Ｘ＋２６．７３３，??Ｒ２＝０．９８８２，擬合程度很好，說明沉淀法提取ＲＮＡ較為穩(wěn)定可靠，且在脾臟量７０?ｍｇ??與８０?ｍｇ處，兩者的ＲＮＡ濃度非常接近，上升趨勢趨于平緩；硅基膜法擬合方程??為Ｙ＝１７．１８４Ｘ＋４４．３９６，?Ｒ２＝０．８８３４，擬合程度較差，結(jié)合圖中曲線走向，由此說明??相較于沉淀法，硅基膜法對駱駝脾臟ＲＮＡ的提取效果不好，穩(wěn)定性差，對于珍貴??的樣品而言，無疑沉淀法是好的選擇。??３：００??｝?＝?３９?７２３Ａ＞２６．７３３?．．．．??二洶０?？?Ｒ：?＝?０．９８８２?＞４．．？？＊？＊＊＇?Ａ??備?一００?．?ｉ??７＝?１７?１８４Ｘ－?４４．３９６??Ｓ?２０００?？?？？？？？，．＊．?？?Ｒ：?＝?０．ＳＳ３４??＾?１５００?？?－??１０００?．?．／？？？？．．．?一一一??一?＿?－?－??５００?．

?內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文?２１＿??３．１．２瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果??利用瓊脂糖凝膠電泳對兩種方法提取的駱駝脾臟組織ＲＮＡ和血液淋巴細胞??ＲＮＡ進行提取質(zhì)量檢測，結(jié)果如圖３和圖４所７Ｋ。如圖３ａ所７Ｋ，對米用沉淀法得??到的駱駝脾臟組織ＲＮＡ做了瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示１０?ｍｇ？８０?ｍｇ的脾臟??添加量均出現(xiàn)３條帶，且條帶的明亮程度逐漸增強，這表明所獲得的ＲＮＡ濃度逐??漸上升，此外條帶較為清晰分明，表明ＲＮＡ基本無降解情況出現(xiàn)，這均與超微量??分光光度計的測定結(jié)果保持一致。由圖３ｂ可知，硅基膜法提取的ＲＮＡ只能看到２８??Ｓ和１８?Ｓ這２個條帶，這與文獻報道的結(jié)果保持一致［９７］；此外ＲＮＡ條帶清晰分明，??基本未有降解，且１０?ｍｇ？５０?ｍｇ脾臟量時，條帶亮度呈逐漸增強的態(tài)勢，而５０?ｍｇ？８０??ｍｇ的脾臟量時，條帶亮度變化較少，這與超微量分光光度計的濃度檢測結(jié)果保持??一致。就柱純化法提�。遥危炼裕洌遥危恋牡寐蕰呌谝粋�飽和值，這與硅基膜??的富集能力有很大關(guān)系，即硅基膜的ＲＮＡ富集能力有限。通過圖４可知，硅基膜??法提取的血液淋巴細胞總ＲＮＡ僅有２８?Ｓ和１８?Ｓ兩條條帶明亮，沉淀法提取的ＲＮＡ??有三條條帶，富集到了分子量小的５?Ｓ條帶，ＲＮＡ收集比較全。??Ｍ?１２３４５６７８?Ｍ?１?２?３?４?５?６?７?Ｓ??ａ沉，芯対：ｉ取睥．眺總ＲＮＡ?ｂ砘坫膜法提収陴臟總ＲＮＡ??圖３駱駝脾臟組織總ＲＮＡ電泳圖??Ｆｉｇ．３?Ｃａｍｅｌ?ｓｐｌｅｅｎ?ｔｉｓｓｕｅ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ??注：１？８，脾臟用量?１０ｍｇ￣８０ｍｇ；?Ｍ，ＤＬ－２?


本文編號：3408501