DNA損傷應(yīng)答是機(jī)體應(yīng)對(duì)損傷作出的一系列反應(yīng)。DNA損傷應(yīng)答有效的協(xié)調(diào),在機(jī)體適應(yīng)環(huán)境、細(xì)胞的分裂、分化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。研究DNA損傷應(yīng)答相關(guān)的分子機(jī)制,將會(huì)加深對(duì)人類(lèi)許多疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的理解,為疾病的預(yù)防和治療提供新的思路和方法。本課題以裂殖酵母（Fission yeast,S.pombe）為模式生物,研究真核生物中DNA損傷應(yīng)答相關(guān)機(jī)制,通過(guò)遺傳篩選方法尋找參與DNA損傷應(yīng)答新的蛋白。ATR/Rad3蛋白是目前已知DNA損傷應(yīng)答中至關(guān)重要的一個(gè)上游蛋白激酶,它參與了DNA損傷應(yīng)答多方面的調(diào)控。在Rad3基因缺失的背景下,篩選出對(duì)DNA損傷藥物敏感表型產(chǎn)生回補(bǔ)的突變株,再通過(guò)對(duì)突變株深度測(cè)序確定相關(guān)突變基因,其中一個(gè)可能參與DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)的新基因?yàn)镃lr1。Clr1蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控蛋白,已報(bào)導(dǎo)的主要功能是參與異染色質(zhì)的組裝。本研究通過(guò)遺傳實(shí)驗(yàn),初步證明了Clr1蛋白與DNA損傷應(yīng)答具有相關(guān)性,且Clr1缺失可以回補(bǔ)Rad3基因缺失對(duì)DNA損傷藥物的敏感性。通過(guò)生化實(shí)驗(yàn),證明在損傷應(yīng)答反應(yīng)時(shí),Clr1蛋白會(huì)受到Rad3蛋白的調(diào)控,再通過(guò)泛素化途徑降解。但Clr1作為Ra... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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遺篩選流程圖

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文3.2 Clr1 缺失可以回補(bǔ) Rad3 缺失對(duì) DNA 損傷藥物的敏感性為了驗(yàn)證遺傳篩選中得到的 Clr1 基因的表型，在野生型和 Rad3 基因缺失的遺傳背景下，同時(shí)將 Clr1 基因敲除，進(jìn)行 DNA 損傷藥物敏感性檢測(cè)。YES 培養(yǎng)板板作為酵母數(shù)量的對(duì)照，在 YES 平板中加入可以導(dǎo)致 DNA 損傷的藥物 CPT。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖（圖 2）所示，在 30℃培養(yǎng) 5 天后，Rad3 缺失菌株對(duì) DNA 損傷藥物表現(xiàn)的非常敏感，而 Clr1 與 Rad3 基因雙缺菌株降低了對(duì) DNA 損傷藥物的敏感。結(jié)果提示，在遺傳學(xué)背景下，Clr1 與 Rad3 基因具有相關(guān)性，Clr1 基因可能參與到Rad3 調(diào)控的通路中。提出假設(shè)機(jī)體在遭受 DNA 損傷后， Rad3 蛋白激酶被激活，可能調(diào)控下游 Clr1 蛋白，使 Clr1 蛋白減少，進(jìn)行一系列效應(yīng)反應(yīng)，對(duì) DNA 損傷做出應(yīng)答。

圖 3 藥物 理后 Clr1 蛋白表達(dá)變化Figure 3 Clr1 protein expression changed after drug treatment DNA 損傷應(yīng)答反應(yīng)中 Clr1 蛋白通過(guò)蛋白酶體途徑降解前面結(jié)果顯示，在 DNA 損傷藥物處理后，Clr1 蛋白量減少，緊隨著便提出問(wèn)Clr1 是如何或通過(guò)什么途徑減少的？有許多文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，在 DNA 損傷應(yīng)答中，蛋白在被激酶磷酸化激活之后，接著會(huì)被泛素化，然后通過(guò)蛋白酶體途徑而。于是便猜想，在 DNA 損傷應(yīng)答過(guò)程中，Clr1 蛋白是否受到 rad3 的磷酸化，接著被泛素化通過(guò)蛋白酶體途徑而降解，從而促進(jìn)機(jī)體的損傷的修復(fù)？帶著與猜想，首先驗(yàn)證 Clr1 蛋白如何減少，MG132 是文獻(xiàn)已報(bào)道的蛋白酶體抑制它可以抑制蛋白酶體，從而抑制蛋白的降解[17]。從（圖 4）結(jié)果來(lái)看，用野生型和 Rad3 突變株進(jìn)行對(duì)照，然后對(duì)細(xì)胞同時(shí)加


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