第一部分（一）研究背景細(xì)胞凋亡是一種主動(dòng)、有序、多基因調(diào)控的細(xì)胞逐漸死亡過(guò)程,是生命的基本現(xiàn)象之一。細(xì)胞凋亡大致可分為caspase依賴的和caspase非依賴的細(xì)胞凋亡兩大類。目前,研究認(rèn)為凋亡誘導(dǎo)因子AIF在caspase非依賴的細(xì)胞凋亡途徑中起著關(guān)鍵作用。1.AIF是定位于線粒體膜間隙的黃素結(jié)合蛋白,其在特定的凋亡誘導(dǎo)信號(hào)刺激下,會(huì)從線粒體轉(zhuǎn)移到核內(nèi)從而引起染色質(zhì)凝縮和DNA片段化。2.研究也發(fā)現(xiàn)與AIF同源的AIFM2（又名AMID）同樣可以引起caspase非依賴的細(xì)胞凋亡。（1）AIFM2在結(jié)構(gòu)上雖然與AIF相比缺失了線粒體定位序列片段,但是均具有與細(xì)菌氧化還原酶高度同源的NADH氧化還原酶區(qū),可以結(jié)合一個(gè)FAD和一個(gè)NADH。（2）AIFM2大部分位于線粒體外膜,少數(shù)位于胞漿。雖然詳細(xì)的機(jī)制還沒(méi)有被研究清楚,已有的報(bào)道表明AIFM2對(duì)細(xì)胞核以及染色質(zhì)的作用與AIF相似。另外bcl-2不能抑制AIFM2誘導(dǎo)的凋亡。為了探究AIFM2發(fā)揮生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機(jī)制,我們對(duì)AIFM2進(jìn)行了結(jié)構(gòu)與功能的初步研究。（二）研究結(jié)果1.我們建立了AIFM2全長(zhǎng)重組蛋白及突變體（含截... 

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圖２－１坐滴法結(jié)晶板中單個(gè)密閉結(jié)晶小室示意圖??

章實(shí)驗(yàn)結(jié)果??ＩＦＭ２全長(zhǎng)蛋白表達(dá)純化及功能初步研宄??蛋白分析??ＡＩＦＭ２蛋白是黃素結(jié)合蛋白，根據(jù)ＡＩＦ家族蛋白的特點(diǎn)，它應(yīng)該至少兩種小分子，即ＦＡＤ和ＮＡＤＨ。根據(jù)ＤＮＡｓｔａｒ軟件對(duì)其組成的分析，長(zhǎng)３７３個(gè)氨基酸，分子量４０．５ｋＤ，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為９．１４。另外，該蛋個(gè)半胱氨酸，在純化過(guò)程中可以考慮加還原型保護(hù)劑，防止蛋白聚用ＰｓｉＰｒｅｄ網(wǎng)站對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。根據(jù)以上分析，我們考慮從表長(zhǎng)蛋白入手，另外構(gòu)建幾個(gè)截短體。其中截短體包括２８－３７３?（截去Ｎ）和１－３１６?（截去Ｃ端Ｐ片區(qū)）。??

?山東大學(xué)碩士學(xué)位論文???３．１．２蛋白表達(dá)與純化??在重組質(zhì)粒ｐＥＴ２８ａ－ｓｕｍｏ－ＡＩＦＭ２測(cè)序正確的情況下，我們首先培養(yǎng)了?１?Ｌ的??菌并誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)鎳柱純化后的蛋白粗品呈黃綠色，見(jiàn)圖３－２，應(yīng)該結(jié)合有ＦＡＤ??分子。ＵＬＰ１蛋白酶切后的蛋白溶液依次進(jìn)行Ｈｅｐａｒｉｎ柱和分子篩（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）??純化，然后進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳檢測(cè)，詳見(jiàn)圖３－３和圖３－４。結(jié)果顯示過(guò)量表達(dá)且??用ＵＬＰ１蛋白酶切開(kāi)后的蛋白條帶與目的蛋白理論值４０．５?ｋＤ吻合，切掉的碎片與??ｓｕｍｏ標(biāo)簽蛋白大�。ǎ保�?ｋＤ）?—致，根據(jù)結(jié)果我們初步判斷蛋白表達(dá)正常可以進(jìn)??行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。??．．


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