通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶的表達(dá)來(lái)優(yōu)化代謝途徑是提高代謝工程產(chǎn)物產(chǎn)量和產(chǎn)率的重要途徑之一。微生物細(xì)胞工廠中通常有數(shù)百至數(shù)千個(gè)代謝反應(yīng),它們之間相互作用形成一個(gè)龐大且緊密聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)。因此,多基因的組合調(diào)控是必要的。實(shí)現(xiàn)組合調(diào)控的方法有很多,例如啟動(dòng)子優(yōu)化,RBS優(yōu)化,基因敲除,核糖開(kāi)關(guān)控制等。這些方法需要基因工程來(lái)改變工程菌株的遺傳信息,操作繁瑣,難度較高。另外還有些不依靠基因重組的方法。例如依賴(lài)于Hfq的小RNA,反義RNA（asRNA）和RNAi等,通過(guò)阻礙mRNA翻譯成蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。但是,這些方法具有較為明顯的脫靶和細(xì)胞毒性。最近,CRISPRi（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference）在基因調(diào)控領(lǐng)域引起了很多關(guān)注。CRISPRi僅需催化失活的Cas蛋白和嵌合單向?qū)NA（sgRNA）,就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因表達(dá)的抑制,已經(jīng)被用在越來(lái)越多的模型菌株和非模型菌株中,在重塑代謝途徑,識(shí)別新的高效代謝酶及優(yōu)化底盤(pán)細(xì)胞等方面發(fā)揮巨大的作用。已經(jīng)有許多使用CRISPRi來(lái)同時(shí)調(diào)控多基因表達(dá)的應(yīng)用,其... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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圖１－１?ＤＮＡ結(jié)合的ＴＦｓ對(duì)啟動(dòng)子的調(diào)控機(jī)制［１３］??ＤＮＡ結(jié)合的ＴＦｓ?（阻遏物和激活物）與目標(biāo)序列的親和力是由一個(gè)或多個(gè)??２??

１?Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ?ｙ’??丄?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?２?令?、?ｇｅｎｅ２?〇??＂ＣＪＨＥＳＩ＾??＾??：???１１１１１１１１１１?＇ｄ??〇Ｐｅｒ３ｔ〇ｒ２?＿＾Ｅ〇?—＾Ｃ〇?＾—ｄＣａｓ９???１?Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ?—ＴＥＤ?—ｉｒＤ??￣￣Ｌ?Ｐｒｏｍｏｔｅｒ?３?＾?＾?＾?〇??￣￣￣????１１１１１１１１１１１?ｌｉ?�。�?１１１?ｉｔｔ??Ｗ?ｏｐｅｒａｔｏｒｓ?Ｗ?、?■１?＾ｌＯ?＝＊＂＾１〇?？｜｜＆＾〇??圖１－３基于ＣＲＩＳＰＲｉ的多基因抑制系統(tǒng)的工作原理??首先使用三個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子構(gòu)建了一個(gè)正交且嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控的多基因誘導(dǎo)表??達(dá)系統(tǒng)作為ｇＲＮＡ表達(dá)的平臺(tái)。由于ＣＲＩＳＰＲｉ基因抑制系統(tǒng)高效且靈敏，少量??的ｇＲＮＡ表達(dá)就可以達(dá)到明顯的抑制效果，這就對(duì)這個(gè)ｇＲＮＡ表達(dá)平臺(tái)調(diào)控的??嚴(yán)謹(jǐn)性提出了極高的要求。因此在完成多基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建后需進(jìn)一步優(yōu)化??其嚴(yán)謹(jǐn)性，降低泄漏表達(dá)。接著對(duì)優(yōu)化后的啟動(dòng)子的表達(dá)參數(shù)及正交性進(jìn)行表征。??最后探究該表達(dá)系統(tǒng)在組合表達(dá)及時(shí)序表達(dá)時(shí)的能力，以提聞基于ＣＲＩＳＰＲｉ的??多基因抑制系統(tǒng)的應(yīng)用潛力。??在完成在ｇＲＮＡ表達(dá)平臺(tái)即多基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建、優(yōu)化及檢測(cè)之后，??將其與ＣＲＩＳＰＲｉ基因抑制工具相結(jié)合，完成多基因抑制系統(tǒng)的構(gòu)建，并檢測(cè)其??抑制效果。之后通過(guò)突變ｇＲＮＡ骨架，降低ｇＲＮＡ與ｄＣａｓ９蛋白的親和性的方??法，進(jìn)一步提高系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)性，盡量消除ｇＲＮＡ泄漏表達(dá)造成的抑制。然后從ｇＲＮＡ??結(jié)合位點(diǎn)，ｓｐａｃｅｒ長(zhǎng)度和誘導(dǎo)啟動(dòng)子等方面探宄影響ＣＲＩＳＰＲｉ抑制效果的因素。??最后以Ｎ－乙酰神經(jīng)氨

制的多基因表達(dá)系統(tǒng)??３．１．１構(gòu)建雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)??使用ＣＲＩＳＰＲｉ基因調(diào)控工具對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行獨(dú)立及組合調(diào)控的前提是使多??個(gè)靶向于不同目的基因的ｇＲＮＡ可以被獨(dú)立的誘導(dǎo)表達(dá)，因此我們實(shí)驗(yàn)的第一??步是構(gòu)建一個(gè)多基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，作為ｇＲＮＡ的表達(dá)平臺(tái)。該平臺(tái)需要滿足??兩個(gè)基本要求，即基因表達(dá)調(diào)控必須嚴(yán)謹(jǐn)（無(wú)泄漏）且誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)各啟動(dòng)子相互??之間無(wú)串?dāng)_�；谶@些需求，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)。首先選擇了研宄??最深入應(yīng)用最成熟的ｌａｃｌ，ｔｅｔＲ和ａｒａＣ用于構(gòu)建系統(tǒng)。如圖３－１所示，ＴＦｓ表達(dá)??質(zhì)粒ｐ３ＴＦｓ－ｌａｃ丨以ＢＢＲ１為復(fù)制子，為抗性標(biāo)記，三個(gè)ＴＦｓ表達(dá)基因（／此人??伙和和三個(gè)ＲＢＳ串聯(lián)成基因簇，由一個(gè)組成型啟動(dòng)子ｐＪ２３１１８啟動(dòng)表??達(dá)。多基因表達(dá)質(zhì)粒ｐＬＴＡｌ以Ｐ１５Ａ為復(fù)制子，辦＾為抗性標(biāo)記，含有三個(gè)誘導(dǎo)??表達(dá)啟動(dòng)子，分別為ｐｌａｃ，?ｐｔｅｔ和ｐｂａｄ，它們分別受ｌａｃｌ，ｔｅｔＲ和ａｒａＣ的調(diào)控，??并由誘導(dǎo)劑ＩＰＴＧ，ａＴｃ和Ａｒａ誘導(dǎo)表達(dá)。各啟動(dòng)子之間由不同的終止子間隔，??避免造成串聯(lián)表達(dá)。當(dāng)不存在誘導(dǎo)劑時(shí)，阻遏蛋白ｌａｄ和ｔｅｔＲ分別結(jié)合在ｐｌａｃ??和ｐｔｅｔ的操縱區(qū)ｌａｃＯ和ｔｅｔＯ上，阻礙ＲＮＡＰ與啟動(dòng)子結(jié)合起始轉(zhuǎn)錄。阻遏－激活??雙功能蛋白ａｒａＣ在缺乏誘導(dǎo)劑Ａｒａ時(shí)也不具備激活轉(zhuǎn)錄的功能。當(dāng)存在相應(yīng)的??誘導(dǎo)劑時(shí)，ｌａｃｌ和ｔｅｔＲ與誘導(dǎo)劑結(jié)合變構(gòu)，從啟動(dòng)子序列上解離下來(lái)，ＲＮＡＰ得??以與啟動(dòng)子結(jié)合。ａｒａＣ也與誘導(dǎo)劑結(jié)合變構(gòu)，與ｐｂａｄ的操縱區(qū)ａｒａｌｉ和ａｒａｈ結(jié)??合并獲得激活功能，與ＣＲＰ?—起招募ＲＮＡＰ起始轉(zhuǎn)錄。???ｒ＊＾?Ｌａｄ?？ＴｅｔＲ?－


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