豬δ冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是一種新發(fā)現(xiàn)的腸道冠狀病毒,能引起新生仔豬腹瀉、嘔吐、脫水、死亡,致死率能達(dá)到30%～40%,嚴(yán)重降低了新生仔豬的存活率,影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。在我國已經(jīng)有多個(gè)省份分離了PDCoV地方株,但至今未見PDCoV陜西地方株分離的報(bào)道。成功分離PDCoV地方株對(duì)陜西地區(qū)PDCoV發(fā)病機(jī)制研究、病毒學(xué)和血清學(xué)分析以及疫苗開發(fā)具有重要意義。表達(dá)PDCoV的結(jié)構(gòu)蛋白為后續(xù)開發(fā)診斷試劑和潛在的PDCoV亞單位疫苗提供了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)采集陜西省西安某豬場腹瀉仔豬的腸道及內(nèi)容物,利用豬睪丸（ST）細(xì)胞進(jìn)行病原分離,細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí),利用RT-PCR方法擴(kuò)增PDCoV西安株M全基因序列并測序,探究其B細(xì)胞表位是否發(fā)生改變。將M基因與表達(dá)載體p ET-32a構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入到BL21（DE3）菌株誘導(dǎo)表達(dá),以純化的重組蛋白免疫小鼠制得多克隆抗體。本研究取得如下結(jié)果:1. PDCoV分離株盲傳5代,感染ST細(xì)胞72 h后出現(xiàn)細(xì)胞病變,主要表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、變大、聚集和脫落。RT-PCR檢測顯示PDCoV陽性,命名為CHN-XA18-35... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

引起豬病毒性疾病的六種冠狀病毒Figure1-1Sixcoronavirusesthatcauseviraldiseasesinswine

腸組織病變及免疫組化染色（Chenetal.2015）

西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文142.3.1PDCoV分離的結(jié)果PDCoV盲傳5代，感染ST細(xì)胞48h后出現(xiàn)輕微細(xì)胞病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，細(xì)胞界限變得不清晰；接毒72h后，細(xì)胞病變更為明顯，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、變大、聚集和脫落（圖2-1）。RT-PCR法檢測病毒培養(yǎng)物發(fā)現(xiàn)，從西安分離的毒株成PDCoV陽性，命名為CHN-XA18-35株。圖2-1PDCoV引起ST細(xì)胞特征性病變（100×）Figure2-1ThecharacteristicpathogenicityofSTcellsafterinfectedbyPDCoV(100×)A.ST細(xì)胞正常形態(tài)；B.PDCoV感染ST細(xì)胞48h后的病變；C.PDCoV感染ST細(xì)胞72h后的病變A.STcellsnormalmorphology;B.Cytopathiceffectafter48hoursofPDCoVinfection;C.Cytopathiceffectafter72hoursofPDCoVinfection2.3.2TCID50計(jì)算結(jié)果連續(xù)觀察一周，待半數(shù)細(xì)胞孔發(fā)生細(xì)胞病變，按照Reed-munch法計(jì)算TCID50，記錄的出現(xiàn)細(xì)胞病變結(jié)果見表2-3。表2-3豬δ冠狀病毒TCID50的觀察記錄結(jié)果Table2-3TheTCID50resultsofPDCoV稀釋度Dilutionration接種細(xì)胞孔Inoculationcellwells無病變孔數(shù)Numberofnon-CPEwells有病變孔數(shù)NumberofCPEwells無病變孔數(shù)累積Totalnumberofnon-CPEwells有病變孔數(shù)累積TotalnumberofCPEwells細(xì)胞病變比例Cytopathicratio出現(xiàn)細(xì)胞病變率(%)Cytopathicrate(%)10-180804343/4310010-280803535/3510010-380802727/2710010-480801919/1910010-582621111/1384.610-6853755/1241.7

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬丁型冠狀病毒CH/GX/1468B/2017的分離鑒定及全基因組序列分析[J]. 秦毅斌,何蘋萍,盧冰霞,何穎,梁家幸,劉磊,段群棚,韋嬪媛,李斌,陳忠偉,周英寧,蘇乾蓮,蔣冬福,盧敬專,趙武.  中國畜牧獸醫(yī). 2019(07)
[2]豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化及鑒定[J]. 王席,李國攀,陳清清,徐保娟,榮俊.  中國畜牧獸醫(yī). 2019(06)
[3]PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 施開創(chuàng),王睿敏,黎宗強(qiáng),謝守玉,尹彥文,陸文俊,屈素潔.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2019(06)
[4]豬δ冠狀病毒N蛋白的原核表達(dá)和間接ELISA檢測方法的建立[J]. 閆瑞杰,張?jiān)骑w,劉玲玲,張紅壘,王亞賓,胡慧.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2019(10)
[5]PEDV分離株S1基因的重組桿狀病毒真核表達(dá)[J]. 何海健,吳瑗,王魯彥,李群景,巴少波,石林,邵春艷,孫靜,姜?jiǎng)?王曉杜.  中國畜牧獸醫(yī). 2019(03)
[6]豬δ冠狀病毒M蛋白的原核表達(dá)、純化與鑒定[J]. 魏姍,石達(dá),陳建飛,馮力,孫東波.  黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(05)
[7]豬流行性腹瀉病毒E基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及融合蛋白的表達(dá)[J]. 鄭亮,鄒德華,程麗鑫,李興志,張雅婷,沈玉江,武雪寧,徐嘉欣,王顯赫,張華,曹宏偉.  黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(04)
[8]2種豬冠狀病毒雙重RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J]. 溫海京,賈超偉,劉芊麟,張喜喜,劉鑫宇,周雙海.  北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào). 2019(01)
[9]豬丁型冠狀病毒S1基因的克隆、原核表達(dá)及多克隆抗體制備[J]. 李成,張雨迪,黃小波,劉浩宇,劉志鵬,趙玉佳,曹三杰,文心田,文翼平,趙勤,伍銳.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(06)
[10]豬丁型冠狀病毒的分離鑒定與基因分析[J]. 劉懷東,孫淼,趙煒,薛青紅,魏春霞,才學(xué)鵬,陳瑞,劉燦,孫曉林.  中國獸藥雜志. 2018(05)

碩士論文
[1]豬δ冠狀病毒的分離、鑒定及熒光定量PCR檢測方法的建立[D]. 肖帥.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[2]豬丁型冠狀病毒HB-BD株分離鑒定及生物學(xué)特性研究[D]. 劉寶京.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[3]豬δ冠狀病毒江西分離株CH/JX/JGS/01的細(xì)胞培養(yǎng)特性與遺傳進(jìn)化分析[D]. 張敏.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[4]豬δ冠狀病毒RT-PCR、RT-LAMP及間接ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用[D]. 張帆帆.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[5]豬丁型冠狀病毒檢測方法的建立及JS-LYG-2014毒株的分離與鑒定[D]. 逄鳳嬌.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017



本文編號(hào)：3358421