目的:納爾遜海灣正呼腸孤病毒（Nelson Bay orthoreoviruses,NBV）最初是40多年前從澳大利亞果蝠中分離出來(lái)的,獨(dú)立形式存在且不與任何疾病發(fā)生關(guān)聯(lián)。然而,最近已經(jīng)證實(shí)了有幾株NBV是人類(lèi)呼吸道感染的病原體,并從一些急性呼吸道疾病患者的體內(nèi)分離出的病原體顯示,NBV已經(jīng)進(jìn)化為人畜共患病的形式,且可在人類(lèi)中傳播。致病性NBV能引起人類(lèi)急性呼吸道及腸道炎癥,并且在東南亞地區(qū)呈逐步漫延的趨勢(shì)。2007年日本學(xué)者TAKAHIRO等首次利用RNA病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng),成功制備出重組NBV-MB,為深入研究NBV致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。自噬是一種真核細(xì)胞為維持細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)進(jìn)行的一種生理性代謝代償過(guò)程。自噬是一種進(jìn)化保守的細(xì)胞自救行為,對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和應(yīng)激條件下細(xì)胞的存活有重要意義。自噬是真核細(xì)胞中進(jìn)化上保守的過(guò)程,降解細(xì)胞內(nèi)底物,參與多種生理過(guò)程,并維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。此外,自噬還具有清除感染細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌和病毒的重要功能。正常情況下,自噬程序處于基礎(chǔ)水平狀態(tài),但是受到各種胞內(nèi)和胞外刺激時(shí)會(huì)被激活。然而,某些病毒顯然不受自噬的影響,許多病毒已進(jìn)化為逃避或利用此機(jī)制以各種方式促進(jìn)其存活和復(fù)制。... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁(yè)數(shù)】：88 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

NBV反向遺傳系統(tǒng)示意圖

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文153結(jié)果3.1重組NBV-MB病毒株的檢測(cè)為了檢測(cè)重組病毒的感染性，用制備的重組NBV-MB病毒感染BHK細(xì)胞，24h后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞變化，并通過(guò)免疫熒光方法檢測(cè)NBV非結(jié)構(gòu)蛋白σNS的表達(dá)情況。如圖1.2A所示，NBV-MB病毒感染的BHK細(xì)胞中，通過(guò)顯微鏡可以觀察到細(xì)胞出現(xiàn)變圓、壞死，從培養(yǎng)皿底壁上脫落，產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathiceffect,CPE），而未感染病毒的細(xì)胞中則未發(fā)現(xiàn)CPE。用制備的NBV-MB病毒感染BHK細(xì)胞24h，進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)NBV非結(jié)構(gòu)蛋白σNS，結(jié)果如圖1.2B所示，NBV-MB病毒感染細(xì)胞檢測(cè)到熒光信號(hào)，而未感染組細(xì)胞未檢測(cè)到熒光信號(hào)。這些結(jié)果證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)成功制備了NBV-MB，并可用于后續(xù)的研究。AB圖1.2重組NBV-MB感染BHK細(xì)胞A：正常光源下顯微鏡觀察感染的BHK細(xì)胞（200×）。B：熒光顯微鏡觀察重組病毒感染的BHK細(xì)胞,紅色熒光標(biāo)記的為σNS蛋白（200×）。

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文163.2空斑檢測(cè)NBV-MB的滴度重組病毒感染單個(gè)細(xì)胞并向四周擴(kuò)散形成肉眼可見(jiàn)可數(shù)的空斑，觀察并計(jì)數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算：病毒滴度(PFU/m1)=(每孔平均空斑個(gè)數(shù)×病毒稀釋度倒數(shù))／每孔病毒接種量(m1)。為了計(jì)數(shù)更精確，一般根據(jù)能清楚觀察到空斑的最大稀釋倍數(shù)的孔計(jì)算，結(jié)果顯示制備的重組病毒滴度為106PFU/ml。因此，制備的重組病毒完全能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。為了滿足后續(xù)試驗(yàn)對(duì)病毒的大量需求，制備的重組病毒通過(guò)L929細(xì)胞進(jìn)行了傳代擴(kuò)增，并通過(guò)空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其滴度，擴(kuò)增得到的重組病毒滴度達(dá)到了108PFU/ml。由此可知，病毒滴度較高,達(dá)到了實(shí)驗(yàn)的要求。圖1.3空斑檢測(cè)L929細(xì)胞擴(kuò)增的NBV-MB滴度A代表未加病毒的空白對(duì)照。B～G代表病毒稀釋度分別依次為10-3～10-8。3.3病毒RNA垂直電泳檢測(cè)分別提取重組病毒NBV-MB和野生NBV病毒RNA，進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳，待電泳結(jié)束將SDS-PAGE凝膠浸入EtBr中，20min后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察，結(jié)果如圖1.4所示，重組NBV-MB的10個(gè)條帶清晰可見(jiàn)，出現(xiàn)大、中、小3類(lèi)共10段條帶：大基因組3條，中基因組3條和小基因組4條，與野生毒株NBV相比條帶分布一致，這說(shuō)明制備的重組病毒NBV-MB的RNA條帶在數(shù)目和分布上都與野生毒株一致。


本文編號(hào)：3357311