【背景】廣泛存在于植物、藻類及其他自養(yǎng)微生物中的核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）是卡爾文循環(huán)中固定CO2的關(guān)鍵酶及限速酶,在生物質(zhì)合成和全球碳循環(huán)中扮演著重要角色。鑒于Rubisco的重要性以及極低的固碳羧化活性,對(duì)Rubisco的篩選進(jìn)化研究具有重要意義�！灸康摹繕�(gòu)建一種適用于篩選高效Rubisco羧化活性的篩選體系�！痉椒ā糠治霈F(xiàn)有篩選體系對(duì)Rubisco羧化活性篩選壓力缺失的原因,設(shè)計(jì)構(gòu)建適用于高效Rubisco羧化活性的篩選體系,以BWLac產(chǎn)乳酸菌株為宿主,在含有5%CO2的N2環(huán)境下厭氧培養(yǎng),比較不同羧化活性Rubisco對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,通過(guò)HPLC及LCMS檢測(cè)總?cè)樗峒肮潭–O2生成乳酸的產(chǎn)量評(píng)估篩選體系�！窘Y(jié)果】通過(guò)終端代謝產(chǎn)物乳酸產(chǎn)生下拉力,以及甘油代謝產(chǎn)生的剩余還原力需要平衡消耗掉的設(shè)計(jì)靶點(diǎn),增強(qiáng)Prk和Rubisco的固碳支路代謝通量,加強(qiáng)RuBP對(duì)細(xì)胞的毒性抑制作用,使細(xì)胞生長(zhǎng)與Rubisco活性有效偶聯(lián),構(gòu)建高通量篩選辦法。在新構(gòu)建的篩選體系中,Rubisco失活突變體BWLac/197不能生長(zhǎng),Rubisco和Prk雙失活突變體BWLa... 

【文章來(lái)源】：微生物學(xué)通報(bào). 2020,47(08)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：11 頁(yè)

【部分圖文】：

高效羧化活性篩選體系Rubisco平板生長(zhǎng)情況

通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)的菌落大小來(lái)表征Rubisco羧化活性的高通量篩選方法，篩選獲得的酶分子是總活性的提高，不能區(qū)別可溶性表達(dá)的提高和比酶活提高的差異，這也是所有酶分子定向進(jìn)化篩選突變體的共性問(wèn)題。此前已有報(bào)道，關(guān)于來(lái)源于Synechococcus sp.PCC6301的Rubisco進(jìn)化，獲得了大亞基Rbc L F345I突變株，其可溶性提高了近7倍，而羧化作用的催化效率降低了17%[14]。為了盡可能避免篩選到可溶性表達(dá)的Rubisco，本研究中應(yīng)用22°C低溫誘導(dǎo)表達(dá)Rubisco，以及25°C的平板篩選培養(yǎng)溫度，目的是盡可能減少Rubisco誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中形成不可溶包涵體，從而降低篩選到Rubisco可溶性表達(dá)提高的可能性。圖6 不同羧化活性Rubisco的產(chǎn)乳酸能力評(píng)價(jià)

針對(duì)2.1節(jié)中現(xiàn)有篩選體系不能篩選獲得羧化活性更高的Rubisco酶分子元件的問(wèn)題，希望通過(guò)增加Prk和Rubisco的固碳支路代謝通量，提高RuBP細(xì)胞毒性的抑制作用，放大Rubisco羧化活性差異在細(xì)胞生長(zhǎng)方面的體現(xiàn)。為此，從兩個(gè)方面考慮設(shè)計(jì)如何增強(qiáng)Rubisco的固碳代謝通量，設(shè)計(jì)原理示意圖如圖2所示。一是以乳酸終端代謝產(chǎn)物形成下拉力，為Rubisco羧化活性固定的CO2找到終端出口，設(shè)計(jì)強(qiáng)化丙酮酸到乳酸終端代謝產(chǎn)物的代謝路徑，阻斷丙酮酸到乙酰CoA的甲酸裂解酶PflB活性，以及丙酮酸到琥珀酸的琥珀酸脫氫酶Frd活性，使乳酸成為細(xì)胞在厭氧條件下丙酮酸代謝的主要代謝終產(chǎn)物，通過(guò)乳酸的代謝生成持續(xù)拉動(dòng)Prk和Rubisco固碳支路；二是依據(jù)甘油代謝產(chǎn)乳酸剩余還原力NADH的特征，見(jiàn)反應(yīng)式(1)，設(shè)計(jì)通過(guò)Prk和Rubisco支路代謝利用木糖，固定CO2生成乳酸，如反應(yīng)式(2)所示，消耗甘油代謝產(chǎn)乳酸剩余的NADH，從而平衡胞內(nèi)還原力，也就是說(shuō)，通過(guò)甘油代謝產(chǎn)乳酸的過(guò)剩還原力，增強(qiáng)Prk和Rubisco固碳支路代謝通量(圖2)。圖2 高效Rubisco羧化活性篩選體系設(shè)計(jì)原理圖


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