目的提供一種制備精氨酸酶特異性多克隆抗體的方法。方法首先對雙孢蘑菇中編碼精氨酸酶的基因（AbArg）進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）擴增,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a（+）-Arg,再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞E.coli BL 21中誘導表達,獲得含有6×His標簽的融合蛋白,最后用純化后的蛋白免疫新西蘭大白兔,獲得抗血清。結(jié)果構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a（+）-Arg,聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析表明誘導出的融合蛋白以包涵體形式存在,經(jīng)純化后得到的融合蛋白純度>90%、濃度>0.5 mg/ml。用間接ELISA法測定抗體的效價達51 200。Western印跡實驗表明制備的多克隆抗體特異性良好,可成功識別雙孢蘑菇中的精氨酸酶蛋白。結(jié)論成功制備了精氨酸酶的多克隆抗體,為進一步研究精氨酸代謝的機制奠定了基礎。 

【文章來源】：國際藥學研究雜志. 2020,47(08)北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

Ab Arg基因的PCR擴增及重組載體的雙酶切驗證注：A.PCR擴增Ab Arg基因；M1.2 kb DNA marker;1.Ab Arg基因的PCR擴增產(chǎn)物；B.重組載體的雙酶切驗證；M2.1kb DNA marker;2.重組質(zhì)粒p ET-28a(+)-Arg被Eco RⅠ和HindⅢ雙酶切

對抗血清進行檢測后發(fā)現(xiàn)非特異性吸附產(chǎn)生的雜帶較多，因此對抗血清進行了純化。用Protein A親和層析介質(zhì)純化Anti-ARG多克隆抗體，Protein A的免疫球蛋白結(jié)合域可特異性地結(jié)合抗體的Fc區(qū)，從而去除其他抗體分子。將純化后抗體進行SDS-PAGE凝膠電泳，結(jié)果表明多數(shù)非特異性抗體被去除干凈，得到了純度較高的Anti-ARG抗體（圖5）。圖4 間接ELISA法測定抗血清的效價

圖3 SDS-PAGE電泳法檢測融合蛋白的親和純化注：M.預染蛋白marker;1.菌體超聲破碎后的沉淀液；2.菌體超聲破碎后的上清液；3.與鎳柱結(jié)合后的流穿液；4～7.親和純化后的洗脫液2.6 WB分析多克隆抗體的特異性

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3348223