為了明確胡楊Pe BZR1基因?qū)}脅迫的響應(yīng),本研究克隆胡楊PeBZR1基因的cDNA序列,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將過表達(dá)載體pBI121-35S::PeBZR1轉(zhuǎn)化野生型煙草,并通過篩選獲得過表達(dá)T₂代的轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株進(jìn)行以下處理:對(duì)照（Control）、100 mmol/L NaCl處理以及200 mmol/L NaCl處理。結(jié)果如下:在正常生長(zhǎng)條件下,轉(zhuǎn)基因煙草植株的長(zhǎng)勢(shì)更好,其根長(zhǎng)和葉總面積較野生型分別增加了28.74%、17.06%;在100 mmol/L Na Cl的處理?xiàng)l件下,轉(zhuǎn)基因煙草的根長(zhǎng)和葉總面積較野生型相比沒有顯著性的差異,但轉(zhuǎn)基因葉片細(xì)胞損傷程度、葉片內(nèi)的H₂O₂和O^2-的積累水平均低于野生型;在200 mmol/L NaCl條件下,轉(zhuǎn)基因煙草根長(zhǎng)和葉總面積較野生型相比分別平均增加了15.41%、65.30%,且轉(zhuǎn)基因葉片細(xì)胞損傷程度、葉片內(nèi)的H₂O₂和O^2-的積累水平均顯著低于野生型,并表現(xiàn)... 

【文章來(lái)源】：基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2020,39(08)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【部分圖文】：

轉(zhuǎn)基因植株NPTⅡ的PCR檢測(cè)(A)和陽(yáng)性植株半定量PCR檢測(cè)(B)

伊文思藍(lán)染色是伊文思藍(lán)與蛋白結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物(圖3A)。通過伊文思藍(lán)染色，發(fā)現(xiàn)在正常條件下，轉(zhuǎn)基因和野生型植株均呈現(xiàn)出少量的藍(lán)色(劉楠和林植芳,2011)。但在100 mmol/L Na Cl處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因株系葉片呈現(xiàn)藍(lán)色區(qū)域均少于野生型。更為顯著的是，在200 mmol/L Na Cl處理?xiàng)l件下，野生型植株上的所有葉片均呈現(xiàn)出深藍(lán)色，而轉(zhuǎn)基因株系中只有最下面的2片的葉片呈現(xiàn)出藍(lán)色，其它部位的葉片只有淺淺的淡藍(lán)色或沒有藍(lán)色顯示。以上結(jié)果表明，異源過表達(dá)Pe BZR1基因可以維持轉(zhuǎn)基因植株葉片在鹽脅迫下的細(xì)胞活性，減輕過量鹽對(duì)細(xì)胞的傷害。3,3"-二氨基聯(lián)苯胺(3,3"-Diaminobenzidine,DAB)染色(圖3B),DAB在過氧化物酶存在的情況下被過氧化氫(H2O2)氧化產(chǎn)生紅棕色沉淀(Kuma et al.,2014)。通過DAB染色，發(fā)現(xiàn)在正常條件下，轉(zhuǎn)基因和野生型植株均呈現(xiàn)出少量的紅棕色。在100 mmol/L Na Cl處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因株系葉片呈現(xiàn)紅棕色區(qū)域均少于野生型。在200 mmol/L Na Cl處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因植株最下面2片葉子均呈現(xiàn)紅棕色，上面2片葉子也出現(xiàn)少許淺紅棕色，而野生型本應(yīng)大范圍著色的卻未著色，推測(cè)可能是因?yàn)楦邼舛塞}脅迫下煙草已出現(xiàn)組織壞死，從而無(wú)法著色。以上結(jié)果表明，異源過表達(dá)Pe BZR1基因可以減少轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫下體內(nèi)H2O2的積累水平。

伊文思藍(lán)能夠滲入破裂細(xì)胞膜與蛋白形成藍(lán)色復(fù)合物，伊文思藍(lán)染色法可檢測(cè)植物整體葉片的細(xì)胞活性，植物在逆境條件下會(huì)受到不同程度的傷害，判定植物受到的傷害程度和檢驗(yàn)其抗逆性的直接和有效的方法是檢測(cè)細(xì)胞活性(劉楠和林植芳,2011)。鹽濃度越高對(duì)煙草的傷害程度越高，藍(lán)色染色區(qū)域越多，則細(xì)胞活性越小。本研究中，伊文思藍(lán)染色形成藍(lán)色區(qū)域，兩個(gè)鹽處理組，轉(zhuǎn)基因植株藍(lán)色區(qū)域均少于野生型，但200 mmol/L Na Cl處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因植株藍(lán)色區(qū)域顯著少于野生型。說(shuō)明異源過表達(dá)Pe BZR1基因可以維持轉(zhuǎn)基因植株葉片在鹽脅迫下的細(xì)胞活性，減輕過量鹽對(duì)細(xì)胞的傷害�；钚匝�(reactive oxygen species,ROS)受到各種生物和非生物脅迫后積累增加，活性氧的積累對(duì)細(xì)胞都有損害作用。組織化學(xué)法檢測(cè)最重要的2種ROS(H2O2和O2-),DAB被H2O2氧化產(chǎn)生紅棕色沉淀，NBT與O2-反應(yīng)形成藍(lán)色難溶性化合物甲臜(Kuma et al.,2014)。紅棕色區(qū)域越多，則細(xì)胞內(nèi)H2O2積累水平越高；藍(lán)色區(qū)域越多，則細(xì)胞內(nèi)O2-水平越高。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]異源表達(dá)胡楊PeCPD基因提高煙草對(duì)鹽、高氮和干旱脅迫的抗性[J]. 陳永富,王陽(yáng),馮倩,唐海,吳英青,高永峰.  應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào). 2017(02)
[2]胡楊耐鹽基因PeuHKT1的克隆與表達(dá)分析[J]. 胥猛,孫子謀,劉思安,陳彩慧,徐立安,黃敏仁.  分子植物育種. 2016(09)
[3]油菜素內(nèi)酯對(duì)氯化鈉脅迫下黃瓜幼苗的緩解效應(yīng)[J]. 陸曉民,楊威.  應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào). 2013(05)
[4]用伊文思藍(lán)染色法檢測(cè)植物整體葉片的細(xì)胞活性[J]. 劉楠,林植芳.  植物生理學(xué)報(bào). 2011(06)



本文編號(hào)：3348072