Tiki基因為新發(fā)現(xiàn)的基因,在蛙上的功能研究證實Tiki在頭部誘導(dǎo)的過程中起著決定性的作用。由于TiKi基因包含TiKi2和TiKi1兩種類型,因此建立一種同時敲除TiKi2和TiKi1兩種基因的兔模型,能更好地研究TiKi基因是否影響兔頭部的早期發(fā)育。本研究通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合原核期受精卵RNA胞質(zhì)內(nèi)顯微注射來建立家兔雙基因打靶技術(shù)體系�？紤]到TiKi1和TiKi2的同源性比較高,可能相互之間存在補(bǔ)償效應(yīng),于是設(shè)計了一個gRNA能同時靶向TiKi1和TiKi2。將200 ng/μL Cas9 mRNA和20 ng/μL gRNA注射到51個處于原核期的家兔受精卵的胞質(zhì)內(nèi),移植到6只受體兔體內(nèi),共計生出12只仔兔,經(jīng)測序鑒定其中有1只仔兔為TiKi1和TiKi2雙等位基因敲除模型。結(jié)果表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)對于家兔雙基因修飾研究是一種高效和簡便的工具,成功建立的TiKi1和TiKi2雙基因敲除兔模型在評估新藥療效、基因治療等的研究領(lǐng)域中將具有很大的應(yīng)用潛力。 

【文章來源】：畜牧與獸醫(yī). 2020,52(03)北大核心

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

新生仔兔Tiki2基因突變結(jié)果

以200 ng/μL Cas9 mRNA和20 ng/μL gRNA的濃度注射處于原核期的家兔受精卵的胞質(zhì)內(nèi),注射的胚胎在胚胎培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至囊胚期(4 d左右),來檢測注射的RNA是否具有對家兔相應(yīng)的靶位點進(jìn)行切割的作用,并統(tǒng)計其打靶效率。當(dāng)注射200 ng/μL Cas9 mRNA和20 ng/μL Tiki1+Tiki2gRNA時,注射12個原核期的受精卵,囊賠率為75%。對這些發(fā)育正常的囊胚進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序基因打靶效率檢測,若測序結(jié)果只有一套峰圖(圖1A),則直接與WT序列進(jìn)行比對;若測序結(jié)果在靶位點附近存在兩套及兩套以上的峰圖(圖1B),則回收該P(yáng)CR產(chǎn)物并與T載體連接,然后挑選單克隆進(jìn)行測序。在這9個囊胚中,經(jīng)過PCR擴(kuò)增測序發(fā)現(xiàn)9個囊胚(100%)都發(fā)生了Tiki1基因打靶,其中在5個(56%)囊胚中檢測到WT的序列,定義為Tiki1單等位基因敲除;剩下的4個(44%)沒有檢測到WT的序列是屬于Tiki1雙等位基因敲除(見表2);經(jīng)過PCR擴(kuò)增測序發(fā)現(xiàn)9個囊胚(100%)都發(fā)生了Tiki2基因打靶,其中在6個(67%)囊胚中檢測到WT的序列,我們定義為Tiki2單等位基因敲除;剩下的3個(33%)沒有檢測到WT的序列是屬于Tiki2雙等位基因敲除(見表2)。表2 注射后家兔受精卵Tiki1和Tiki2基因修飾結(jié)果 靶基因 濃度(gRNA/cas9) 囊胚數(shù) 基因修飾效率(%) 雙等位基因敲除率(%) Tiki1 20/200(ng/μL) 9 9/9(100) 4/9(44) Tiki2 20/200(ng/μL) 9 9/9(100) 3/9(33)

對測序結(jié)果在靶位點附近存在兩套及兩套以上峰圖的仔兔的PCR 產(chǎn)物,回收并與T載體連接,然后挑選單克隆進(jìn)行測序,再與WT序列比對,突變范圍從插入21 bp到缺失209 bp不等(圖3)。圖3 新生仔兔Tiki2基因突變結(jié)果


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