重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）是利用重組酶和單鏈結(jié)合蛋白在常溫下協(xié)同實(shí)現(xiàn)引物與模板的特異結(jié)合,以代替?zhèn)鹘y(tǒng)PCR熱循環(huán)中的變性和復(fù)性過程的新型恒溫體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。本研究基于RPA技術(shù)建立了轉(zhuǎn)基因玉米TC1507的檢測(cè)方法,可在36.7℃恒溫條件下快速檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因玉米TC1507中的保守區(qū)段,具有較好的特異性,其檢測(cè)靈敏度達(dá)到了10-2ng/μL,檢測(cè)時(shí)間只需5分鐘,適用于基層實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米TC1507及其制品;此外,對(duì)于金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SAU）,建立了一種基于重組酶聚合酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RPA）快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法。方法根據(jù)金黃色葡萄球菌基因保守序列設(shè)計(jì)的2對(duì)引物,以金黃色葡萄球菌陽性菌株和其他7種非金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板,考察該方法的檢測(cè)靈敏度和特異性。結(jié)果RPA快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌方法僅需5 min,檢測(cè)靈敏度為101cfu/μL;7種非金黃色葡萄球菌均不能擴(kuò)增,特異性較強(qiáng)。本研究建立了金黃色葡萄球菌的RPA快速檢測(cè)方法,具有... 

【文章來源】：上海師范大學(xué)上海市

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

RPA擴(kuò)增的原理

上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文第2章轉(zhuǎn)基因玉米TC1507的RPA方法的建立17特定的設(shè)計(jì)引物軟件，因此需要人工手動(dòng)根據(jù)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物。由此設(shè)計(jì)了3組特異性較好的引物，合成后進(jìn)行引物篩眩（具體序列見表1同2.1.1）實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。其中T10泳道的擴(kuò)增效果較好，因此選用T10-F/T10-R作為后續(xù)RPA擴(kuò)增反應(yīng)的引物。M：Marker；T6：轉(zhuǎn)基因玉米TC1507-T6-F/T6-R；N6：非轉(zhuǎn)基因玉米-T6-F/T6-R；T9：轉(zhuǎn)基因玉米TC1507-T9-F/T9-R；N6:非轉(zhuǎn)基因玉米-T9-F/T9-R；T10.轉(zhuǎn)基因玉米TC1507-T10-F/T10-R；N10.非轉(zhuǎn)基因玉米-T10-F/T10-R；2.3.2轉(zhuǎn)基因玉米TC1507RPA反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化和溫度優(yōu)化通過比對(duì)獲取的模板和優(yōu)化后的引物，對(duì)RPA擴(kuò)增反應(yīng)所需要的反應(yīng)條件進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化，對(duì)RPA反應(yīng)溫度和RPA反應(yīng)時(shí)間分別進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)參考大量文獻(xiàn)得知通常RPA的反應(yīng)溫度通常在32℃至42℃之間，因此我們?cè)?2℃至42℃之間按照溫度從低到高選取了11個(gè)溫度梯度進(jìn)行RPA擴(kuò)增試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3，其中在第5和第6泳道有明顯條帶，最終選取36.7℃作為最適溫度。M：Marker；1：32℃；2：32.5℃；3：33.2℃；4：34.1℃；5：35.5℃；6：36.7℃；7：37.6℃；8：38.9℃；9：40.1℃；10：41.1℃；11：41.7℃圖2TC1507RPA引物篩選結(jié)果Fig.2ScreeningofRPAprimerforTC1507圖3TC1507RPA反應(yīng)溫度優(yōu)化Fig.3RPAtemperatureoptimizationofTC1507

第2章轉(zhuǎn)基因玉米TC1507的RPA方法的建立上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文18同時(shí)對(duì)反應(yīng)時(shí)間做了進(jìn)一步優(yōu)化，將反應(yīng)時(shí)間從5min至20min按照時(shí)間從短到長(zhǎng)選取了4個(gè)溫度梯度分別進(jìn)行RPA擴(kuò)增試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如圖4，其中第3、5、7泳道效果都較為理想，但第三泳道時(shí)間較短，只有8min，適合于快速檢測(cè)，其條帶也較為明亮。所用最終選取8min作為最終反應(yīng)時(shí)間。M：Marker；1：5min；2：空白對(duì)照（ddH2O）/5min；3：8min；4：空白對(duì)照（ddH2O）/8min；5：15min；6：空白對(duì)照（ddH2O）/15min；7：20min；8：空白對(duì)照（ddH2O）/20min2.3.3轉(zhuǎn)基因玉米TC1507RPA特異性驗(yàn)證采用2.3.1篩選出的引物T10-F/T10-R，2.3.2優(yōu)化后的反應(yīng)溫度36.7℃，反應(yīng)時(shí)間8min作為反應(yīng)條件，對(duì)本實(shí)驗(yàn)的特異性進(jìn)行了檢測(cè)，由圖1的N10泳道和圖3的4泳道作為實(shí)驗(yàn)特異性試驗(yàn)的前提條件，分別以非轉(zhuǎn)基因玉米和ddH2O作為模板，幾乎沒有非特異性條帶，證明在實(shí)驗(yàn)過程中基本可以避免實(shí)驗(yàn)污染。分別對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米TC1507、轉(zhuǎn)基因玉米BT176、轉(zhuǎn)基因玉米GA21，以及采購于市場(chǎng)的非轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、油菜籽、小麥和棉花抽提DNA進(jìn)行RPA擴(kuò)增試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5，僅在第1泳道有條帶，說明該體系的特異性較好。為了更加快速直觀地觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在RPA擴(kuò)增反應(yīng)停止后，在RPA擴(kuò)增反應(yīng)0.2mL的eppendorf管中分別加入2μL的105×SYBRGreenI染料，渦旋震蕩后在陽光或者日光燈下通過肉眼觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，僅在第1泳道呈陽性綠色，其余泳道均為橘色，再次證實(shí)了該體系對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米TC1507的特異性較好。圖4TC1507RPA反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化Fig.4RPAtimeoptimizationofTC1507

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本文編號(hào)：3345050