采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù),構(gòu)建G-蛋白偶聯(lián)受體41（gpr41）基因敲除的RAW264.7細(xì)胞系。利用慢病毒轉(zhuǎn)染,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的巨噬細(xì)胞株。針對gpr41基因作用的功能區(qū)域,設(shè)計靶向gpr41基因的向?qū)NA（gRNA）,構(gòu)建pLenticrisprV2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選出重組子測序驗(yàn)證gRNA的有效性。鑒定成功的pLenticrisprV2-gpr41-gRNA重組質(zhì)粒采用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞系RAW264.7。篩選陽性單克隆細(xì)胞株,Western blot檢測gpr41基因的表達(dá)。測序結(jié)果證實(shí)pLenticrisprV2-gpr41-gRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功;Western blot篩選出重組質(zhì)粒pLenticrisprV2-gpr41-gRNA3轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞13號單克隆株的GPR41蛋白不表達(dá)。利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建了gpr41基因敲除的巨噬細(xì)胞株,為研究gpr41基因在RAW264.7細(xì)胞中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報. 2020,55(05)北大核心

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

pLenticrisprV2質(zhì)粒酶切圖

選擇野生型細(xì)胞系和敲除型細(xì)胞系在蛋白水平上檢測GPR41表達(dá)情況。Western blot結(jié)果顯示,野生型細(xì)胞中GPR41蛋白正常表達(dá),而敲除型細(xì)胞中檢測不到GPR41蛋白的表達(dá)(圖2)。圖2 GPR41蛋白水平檢測

GPR41蛋白水平檢測

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]巨噬細(xì)胞:一種理想的細(xì)胞骨架觀察教學(xué)材料[J]. 薛雅蓉,莊重,候冬霞,汪水娟.  中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報. 2019(09)
[2]Short-chain fatty acids act as antiinflammatory mediators by regulating prostaglandin E2 and cytokines[J]. Mary Ann Cox,James Jackson,Michaela Stanton,Alberto Rojas-Triana,Loretta Bober,Maureen Laverty,Frederick Monsma,Galya Vassileva,Maureen Maguire,Eric Gustafson,Marvin Bayne,Daniel Lundell,Chung-Her Jenh.  World Journal of Gastroenterology. 2009(44)



本文編號：3339806