旨在研究大腸桿菌產(chǎn)磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C （PI-PLC）的發(fā)酵表達和分離純化,探究PI-PLC酶切GPI錨定蛋白的效果。依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中蠟樣芽孢桿菌的PI-PLC的基因序列,按照大腸桿菌的密碼子偏好性進行密碼子優(yōu)化,合成相應基因序列并構(gòu)建基因表達載體pGEX-6P-1-PI-PLC。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌E.cOli BL21 （DE3）中,通過加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導目的基因PI-PLC表達。經(jīng)檢測,含有GST標簽的PI-PLC融合蛋白以可溶蛋白形式存在于菌體破碎上清,分子量約為61 kDa,與預期相符。初步優(yōu)化誘導表達條件后,發(fā)現(xiàn)最佳誘導表達條件為:以接種量5%接種體積分數(shù)接種,待菌體生長至OD_600nm達到0.5,在16℃條件下以0.3 mmol/L濃度IPTG誘導24 h。利用GST標簽對蛋白進行純化,純化后的PI-PLC質(zhì)量濃度為0.52 mg/mL,比酶活為1 322.5 U/mg。利用PI-PLC酶液對哺乳動物細胞表面的模式GPI錨定蛋白CD59進行酶切,酶切作用顯著。因此,下一步可以將PI-PLC融合蛋白應用于細胞生物... 

【文章來源】：生物技術通報. 2020,36(01)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

利用SDS-PAGE鑒定重組蛋白的誘導表達和純化

在最佳條件下發(fā)酵PI-PLC并純化，純化后酶的質(zhì)量濃度為0.52 mg/mL,20μL純化酶液含有酶活為14 U，經(jīng)計算比酶活為1 322.5 U/mg。2.6 用PI-PLC處理膀胱癌細胞

國外對磷脂酶C的基因序列、結(jié)構(gòu)、功能、酶學性質(zhì)及應用等相關研究開始較早，對細菌來源的磷脂酶C在不同體系內(nèi)的克隆表達和其在工業(yè)和醫(yī)學方面的應用也有報道[14-15]。相比較而言，國內(nèi)對細菌來源的磷脂酶C尤其是磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C的研究較少，主要集中在磷脂酶C在油脂脫膠、飼料抗蟲等方面的應用研究。2016年，湯先澤[16]對磷脂酰肌醇進行了異源表達，并對其粗酶液的抗雞球蟲效果進行了初步分析；2019年，鄒全等[17]對磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C和磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C在枯草芽孢桿菌中進行表達，并利用其粗酶液對兩種酶的酶學性質(zhì)進行了分析并應用于油脂脫膠，然而，對磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C的純化及其酶活性研究較少。同時，GPI錨定的形式可以使細胞膜表面結(jié)合更多蛋白[18]，其中哺乳細胞中的一些細胞粘附分子、淋巴細胞分化抗原、補體調(diào)節(jié)蛋白等具有一定功能性的蛋白通過GPI錨定的形式存于細胞膜表面[19]，這些蛋白和哺乳動物的很多生理過程息息相關[20]，然而對GPI錨定蛋白的研究還遠遠不夠。磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C可以專一作用于GPI錨定蛋白的磷脂酰肌醇的磷酸二酯鍵，進而使GPI錨定蛋白從細胞膜上釋放下來。表達和純化高效的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C，從而將其更好地應用于對GPI錨定蛋白的研究與鑒定中，可為研究GPI錨定蛋白的生物學功能等提供有效幫助。由于本實驗中PI-PLC來源于蠟狀芽孢桿菌，其結(jié)構(gòu)與哺乳動物體內(nèi)切割GPI錨定蛋白的酶結(jié)構(gòu)具有相似性，且不作為毒力因子[21]，因此后續(xù)工作可把磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C在細胞生物學實驗中進行應用。4 結(jié)論

【參考文獻】：
期刊論文
[1]磷脂酰膽堿特異性和磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C酶學性質(zhì)及其在油脂脫膠中的應用[J]. 鄒權(quán),陳圣,嚴明.  生物加工過程. 2019(02)
[2]磷脂酶C基因家族研究進展[J]. 王法微,王騏,鄧宇,董金曄,王南,李曉薇,李海燕.  生物技術通報. 2014(12)
[3]磷脂酶C用于大豆油脫膠的工藝優(yōu)化[J]. 楊嬌,金青哲,王興國.  中國油脂. 2012(12)

碩士論文
[1]磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C基因的克隆、表達及抗雞球蟲效果的初步研究[D]. 湯先澤.齊魯工業(yè)大學 2016



本文編號：3325377