為了探尋微觀世界的奧秘,顯微技術(shù)自16世紀(jì)發(fā)明以來,已經(jīng)得到了巨大的發(fā)展。除了不斷提升的分辨率之外,它們的種類和應(yīng)用領(lǐng)域也越來越廣泛。光學(xué)顯微鏡因其非直接接觸、損傷小的特性,往往是生物樣品觀測的優(yōu)先選擇。近年來,各類熒光探針的發(fā)展為生物結(jié)構(gòu)成像提供了豐富的選擇與方法。其中,光可控的熒光蛋白與染料分子也使遠(yuǎn)場光學(xué)顯微技術(shù)得以突破光學(xué)衍射極限,最為典型的就是光激活定位顯微成像技術(shù)（photoactivated localization microscopy,PALM）與隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)（stochastic optical reconstruction microscopy,STORM）。本文的研究工作基于常見的原核生物——大腸桿菌而進(jìn)行,同時結(jié)合了熒光顯微技術(shù)與其他實驗手段。大腸桿菌具有繁殖快、培養(yǎng)簡單、毒性較小等優(yōu)勢,是研究最為廣泛的細(xì)菌之一。本文的第一章為緒論部分,較為詳細(xì)地介紹了研究領(lǐng)域的背景與已取得的成果,并總結(jié)了研究工作的目標(biāo)與意義。我們的研究對象主要包括大腸桿菌與光激活熒光蛋白（photoactivatable fluorescent proteins,PA-FPs）,在... 

【文章來源】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：122 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１．１熒光發(fā)射過程中的Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ能級圖

而多管??水母屬會發(fā)出綠光而不是藍(lán)光的原因也被Ｍｏｒｉｓｅ等人所揭示出來。原來在水母??體內(nèi)還存在著另一種綠色焚光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ），水母素發(fā)射??的藍(lán)光在ＧＦＰ?．的吸收譜內(nèi)，導(dǎo)致這兩種蛋白之間發(fā)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移??（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｒｅｓｏｎａｎｃｅ?ｅｎｅｒｇｙ?ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ），從而刺激?ＧＦＰ?發(fā)出綠色焚光，??造成了次級熒光光譜的紅移［３］。接下來，Ｓｈｉｍｏｍｕｒ又研宄了?ＧＦＰ的發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)??Ｗ，如圖１．２所示。與水母素所需要的較為復(fù)雜的發(fā)光條件不同，當(dāng)ＧＦＰ暴露在??紫外光或藍(lán)光中，它就能發(fā)出綠色的熒光。正是由于這種特性，它引起了許多生??物學(xué)家的關(guān)注。然而，僅僅將ＧＦＰ提純出來并不能滿足科學(xué)要求。要想成功利??用ＧＦＰ進(jìn)行生物結(jié)構(gòu)的標(biāo)記、示蹤等研究，還需在基因?qū)用嫔线M(jìn)行解析，讓ＧＦＰ??能夠在生物體內(nèi)完成自主表達(dá)。??纖??Ａｅｑｕｏｒｅａ?ｖｉｃｔｏｒｉａ??ｈｉｇｈ?ｅｎｅｒｇｙ?ｌｏｗ?ｅｎｅｒｇｙ??■?：ａ：ｉ??圖１．２發(fā)出綠色黃光的維多利亞多管水母。（圖片來源：ｗｗｗ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ）??１９９２年，Ｐｒａｓｈｅｒ等人成功地克隆了?ＧＦＰ的ｃＤＮＡ，為熒光蛋白標(biāo)簽應(yīng)用于??生物學(xué)觀察提供了基因?qū)用嫔系囊罁?jù)。同時，他們也分析了?ＧＦＰ的一級結(jié)構(gòu)，??為進(jìn)一步理解ＧＦＰ的發(fā)光特性提供了幫助［５］。１９９４年，Ｃｈａｌｆｉｅ等人首次將熒光??蛋白克隆到大腸桿菌和線蟲中并成功表達(dá)，并得出了?ＧＦＰ發(fā)光并不需要其他底??物或者共同作用因子的結(jié)論［６］，如圖１．３所示。這一研宄成果迅速引起了轟動，??許多科學(xué)家紛紛效仿，

?第１章緒論???ａｂｅｄ?ｅ??圖１．３?Ｃｈａｌｆｉｅ等人利用ＧＦＰ觀察到線蟲的細(xì)胞分化過程。??（圖片來源：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｏｂｅｌｐｒｉｚｅ．ｏｒｇ／ｐｒｉｚｅｓ／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／２００８／ｐｒｅｓｓ－ｒｅｌｅａｓｅ／）??盡管科學(xué)家們對ＧＦＰ的運(yùn)用投入了巨大的熱情，然而，由于野生型ＧＦＰ的??熒光亮度不夠強(qiáng)，而且在異源生物體內(nèi)的標(biāo)記效率較低，因此，在實際觀測中仍??然存在著較大的局限性。為了解決這些問題，華裔科學(xué)家錢永健（ＲｏｇｅｒＹＴｓｉｅｎ）??做出了杰出的貢獻(xiàn)。他帶領(lǐng)研宄者們詳細(xì)闡釋了?ＧＦＰ的發(fā)光原理［７］，并基于ＧＦＰ??的晶體結(jié)構(gòu)，通過定點(diǎn)或隨機(jī)的基因突變的手段進(jìn)行改造，開發(fā)了一系列功能更??強(qiáng)、更適用于實驗觀測的熒光蛋白。其中最為廣泛使用的就是由ＧＦＰ衍生而來??的增強(qiáng)型綠色焚光蛋白（ｅｎｈａｎｃｅｄ?ｇｒｅｅｎ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧＦＰ）以及?Ｅｍｅｒａｌｄ??（祖母綠）。除此之外，他們還發(fā)現(xiàn)了藍(lán)色、青色以及黃色的新型熒光蛋白，大??大豐富了熒光蛋白的種類與實用性［８－１１］。后來，研宄人員們又在珊瑚蟲和海葵中??發(fā)現(xiàn)了紅色焚光蛋白（ｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＲＦＰ），為熒光蛋白的多色成像提供??了更多的選擇［１２，１３］（見圖１．４）。??圖１．４基于從水母中提取的綠色熒光蛋白和從珊瑚蟲中提取的紅色熒光蛋白，衍生出的多??色熒光蛋白家族【１１］。??３??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]近場光學(xué)與近場光學(xué)顯微鏡[J]. 朱星.  北京大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 1997(03)



本文編號：3242511