為了探尋微觀(guān)世界的奧秘,顯微技術(shù)自16世紀(jì)發(fā)明以來(lái),已經(jīng)得到了巨大的發(fā)展。除了不斷提升的分辨率之外,它們的種類(lèi)和應(yīng)用領(lǐng)域也越來(lái)越廣泛。光學(xué)顯微鏡因其非直接接觸、損傷小的特性,往往是生物樣品觀(guān)測(cè)的優(yōu)先選擇。近年來(lái),各類(lèi)熒光探針的發(fā)展為生物結(jié)構(gòu)成像提供了豐富的選擇與方法。其中,光可控的熒光蛋白與染料分子也使遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微技術(shù)得以突破光學(xué)衍射極限,最為典型的就是光激活定位顯微成像技術(shù)（photoactivated localization microscopy,PALM）與隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)（stochastic optical reconstruction microscopy,STORM）。本文的研究工作基于常見(jiàn)的原核生物——大腸桿菌而進(jìn)行,同時(shí)結(jié)合了熒光顯微技術(shù)與其他實(shí)驗(yàn)手段。大腸桿菌具有繁殖快、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、毒性較小等優(yōu)勢(shì),是研究最為廣泛的細(xì)菌之一。本文的第一章為緒論部分,較為詳細(xì)地介紹了研究領(lǐng)域的背景與已取得的成果,并總結(jié)了研究工作的目標(biāo)與意義。我們的研究對(duì)象主要包括大腸桿菌與光激活熒光蛋白（photoactivatable fluorescent proteins,PA-FPs）,在... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)安徽省 211工程院校 985工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖１．１熒光發(fā)射過(guò)程中的Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ能級(jí)圖

而多管??水母屬會(huì)發(fā)出綠光而不是藍(lán)光的原因也被Ｍｏｒｉｓｅ等人所揭示出來(lái)。原來(lái)在水母??體內(nèi)還存在著另一種綠色焚光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ），水母素發(fā)射??的藍(lán)光在ＧＦＰ?．的吸收譜內(nèi)，導(dǎo)致這兩種蛋白之間發(fā)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移??（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｒｅｓｏｎａｎｃｅ?ｅｎｅｒｇｙ?ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ），從而刺激?ＧＦＰ?發(fā)出綠色焚光，??造成了次級(jí)熒光光譜的紅移［３］。接下來(lái)，Ｓｈｉｍｏｍｕｒ又研宄了?ＧＦＰ的發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)??Ｗ，如圖１．２所示。與水母素所需要的較為復(fù)雜的發(fā)光條件不同，當(dāng)ＧＦＰ暴露在??紫外光或藍(lán)光中，它就能發(fā)出綠色的熒光。正是由于這種特性，它引起了許多生??物學(xué)家的關(guān)注。然而，僅僅將ＧＦＰ提純出來(lái)并不能滿(mǎn)足科學(xué)要求。要想成功利??用ＧＦＰ進(jìn)行生物結(jié)構(gòu)的標(biāo)記、示蹤等研究，還需在基因?qū)用嫔线M(jìn)行解析，讓?zhuān)牵疲??能夠在生物體內(nèi)完成自主表達(dá)。??纖??Ａｅｑｕｏｒｅａ?ｖｉｃｔｏｒｉａ??ｈｉｇｈ?ｅｎｅｒｇｙ?ｌｏｗ?ｅｎｅｒｇｙ??■?：ａ：ｉ??圖１．２發(fā)出綠色黃光的維多利亞多管水母。（圖片來(lái)源：ｗｗｗ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ）??１９９２年，Ｐｒａｓｈｅｒ等人成功地克隆了?ＧＦＰ的ｃＤＮＡ，為熒光蛋白標(biāo)簽應(yīng)用于??生物學(xué)觀(guān)察提供了基因?qū)用嫔系囊罁?jù)。同時(shí)，他們也分析了?ＧＦＰ的一級(jí)結(jié)構(gòu)，??為進(jìn)一步理解ＧＦＰ的發(fā)光特性提供了幫助［５］。１９９４年，Ｃｈａｌｆｉｅ等人首次將熒光??蛋白克隆到大腸桿菌和線(xiàn)蟲(chóng)中并成功表達(dá)，并得出了?ＧＦＰ發(fā)光并不需要其他底??物或者共同作用因子的結(jié)論［６］，如圖１．３所示。這一研宄成果迅速引起了轟動(dòng)，??許多科學(xué)家紛紛效仿，

?第１章緒論???ａｂｅｄ?ｅ??圖１．３?Ｃｈａｌｆｉｅ等人利用ＧＦＰ觀(guān)察到線(xiàn)蟲(chóng)的細(xì)胞分化過(guò)程。??（圖片來(lái)源：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｏｂｅｌｐｒｉｚｅ．ｏｒｇ／ｐｒｉｚｅｓ／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／２００８／ｐｒｅｓｓ－ｒｅｌｅａｓｅ／）??盡管科學(xué)家們對(duì)ＧＦＰ的運(yùn)用投入了巨大的熱情，然而，由于野生型ＧＦＰ的??熒光亮度不夠強(qiáng)，而且在異源生物體內(nèi)的標(biāo)記效率較低，因此，在實(shí)際觀(guān)測(cè)中仍??然存在著較大的局限性。為了解決這些問(wèn)題，華裔科學(xué)家錢(qián)永健（ＲｏｇｅｒＹＴｓｉｅｎ）??做出了杰出的貢獻(xiàn)。他帶領(lǐng)研宄者們?cè)敿?xì)闡釋了?ＧＦＰ的發(fā)光原理［７］，并基于ＧＦＰ??的晶體結(jié)構(gòu)，通過(guò)定點(diǎn)或隨機(jī)的基因突變的手段進(jìn)行改造，開(kāi)發(fā)了一系列功能更??強(qiáng)、更適用于實(shí)驗(yàn)觀(guān)測(cè)的熒光蛋白。其中最為廣泛使用的就是由ＧＦＰ衍生而來(lái)??的增強(qiáng)型綠色焚光蛋白（ｅｎｈａｎｃｅｄ?ｇｒｅｅｎ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧＦＰ）以及?Ｅｍｅｒａｌｄ??（祖母綠）。除此之外，他們還發(fā)現(xiàn)了藍(lán)色、青色以及黃色的新型熒光蛋白，大??大豐富了熒光蛋白的種類(lèi)與實(shí)用性［８－１１］。后來(lái)，研宄人員們又在珊瑚蟲(chóng)和海葵中??發(fā)現(xiàn)了紅色焚光蛋白（ｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＲＦＰ），為熒光蛋白的多色成像提供??了更多的選擇［１２，１３］（見(jiàn)圖１．４）。??圖１．４基于從水母中提取的綠色熒光蛋白和從珊瑚蟲(chóng)中提取的紅色熒光蛋白，衍生出的多??色熒光蛋白家族【１１］。??３??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]近場(chǎng)光學(xué)與近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡[J]. 朱星.  北京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 1997(03)



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