纖維小體是附著在部分厭氧微生物細胞壁外的一種天然多酶復合體,可以高效催化降解木質(zhì)纖維素,其結構穩(wěn)定性強,組裝靈活。目前依靠纖維小體在多種微生物表面實現(xiàn)了多酶系統(tǒng)的高效聚合,在提高多酶協(xié)同效率方面具有較大的應用潛力,但其在細胞內(nèi)始終無法實現(xiàn)自組裝。本研究選定纖維小體為胞內(nèi)自組裝體系的基本模型,并選擇其關鍵元件（對接蛋白及粘連蛋白）作為主要研究對象,以大腸桿菌為平臺,著重對其自組裝機制進行探索與分析,并采用理性設計方法對對接蛋白進行定向改造,再結合實驗尋找適合在胞內(nèi)組裝的突變方向,并構建適用于高通量篩選的流式篩選體系,為以纖維小體為模型的胞內(nèi)自組裝體系的成功構建夯實基礎。研究結果分為以下三個方面:（1）選擇已解析出其晶體結構的I型對接蛋白Doc A和粘連蛋白Coh作為研究對象,下載其三維結構并用Py MOL等軟件進行分析,發(fā)現(xiàn)對接蛋白有2個鈣離子結合位點。后將兩蛋白分別在大腸桿菌中進行表達,再利用分子互作儀對兩蛋白的結合機制進行初步探究。研究發(fā)現(xiàn),對接蛋白和粘連蛋白的穩(wěn)定結合需要5×10^-4 mol/L左右的鈣離子濃度的參與,當鈣離子濃度在0～5×10^-3<... 

【文章來源】：齊魯工業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 引言
    1.2 多酶復合體
        1.2.1 多酶復合體簡介
        1.2.2 胞內(nèi)多酶復合體的研究現(xiàn)狀
    1.3 天然多酶自組裝體系——纖維小體
        1.3.1 纖維小體簡介
        1.3.2 熱纖梭菌的纖維小體
        1.3.3 以纖維小體為基礎的催化體系的設計進展
    1.4 研究的內(nèi)容及意義
        1.4.1 研究內(nèi)容
        1.4.2 研究意義
第2章 自組裝體系的選擇與表達
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 菌株與質(zhì)粒
        2.2.2 主要試劑
        2.2.3 培養(yǎng)基與溶液
        2.2.4 主要儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 目的蛋白的篩選及獲得
        2.3.2 蛋白DocA-G與蛋白Coh的表達與純化
        2.3.3 蛋白DocA-G與蛋白Coh結合機制的初步探究
    2.4 結果與討論
        2.4.1 蛋白Coh與對接蛋白DocA-G的表達與純化
        2.4.2 粘連蛋白與對接蛋白對接機制的探究
    2.5 本章小結
第3章 對接蛋白的設計及驗證
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 菌株與質(zhì)粒
        3.2.2 主要試劑
        3.2.3 培養(yǎng)基與溶液
        3.2.4 主要儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 單位點突變體的設計及獲得
        3.3.2 雙位點突變體的設計及獲得
        3.3.3 對接突變蛋白的表達及純化
        3.3.4 突變體與蛋白Coh結合對鈣離子依賴性檢測
    3.4 結果與討論
        3.4.1 單位點突變體與蛋白Coh結合機制的探究
        3.4.2 雙位點突變體與蛋白Coh結合機制的探究
        3.4.3 單、雙位點突變體與蛋白Coh結合的比較
    3.5 本章小結
第4章 關鍵元件-熒光蛋白融合及流式篩選體系構建
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 菌株與質(zhì)粒
        4.2.2 主要試劑
        4.2.3 培養(yǎng)基與溶液
        4.2.4 主要儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 表面展示體系的構建
        4.3.2 基于兩種熒光信號的流式篩選體系的初步構建
        4.3.3 基于一種熒光信號的流式篩選體系的初步構建
    4.4 結果與討論
        4.4.1 表面展示體系的構建
        4.4.2 纖維小體元件-熒光蛋白融合構建
        4.4.3 基于一種熒光信號的流式篩選體系的初步構建
    4.5 本章小結
第5章 總結與展望
    5.1 研究總結
    5.2 未來展望
參考文獻
致謝
在學期間主要科研成果


【參考文獻】：
期刊論文
[1]利用SpyTag/SpyCatcher構建胞內(nèi)自組裝多酶復合體實現(xiàn)高效生物合成[J]. 劉璐,殷亮,黃飛,張勇,劉倩,馮雁.  中國生物工程雜志. 2018(07)
[2]冰晶核蛋白及其在細菌表面展示技術中的應用[J]. 李明亞,林陳水.  氨基酸和生物資源. 2016(02)
[3]重組柞蠶抗菌肽AD對E.coli抗菌機制研究[J]. 張倩,鄧平建,王興順,李浩,楊小柯,耿藝介.  中國熱帶醫(yī)學. 2014(11)
[4]蛹擬青霉液體深層發(fā)酵菌絲體抗氧化活性和抑菌活性分析[J]. 邵穎,陳安徽,陳宏偉.  食品工業(yè). 2011(07)

博士論文
[1]自組裝多酶納米反應器的設計與構建[D]. 殷亮.上海交通大學 2018
[2]大腸桿菌多酶自組裝合成衣康酸及代謝工程研究[D]. 楊中偉.華東理工大學 2018
[3]基于纖維小體腳手架蛋白的多酶共展示體系構建[D]. 王亮亮.南京林業(yè)大學 2016



本文編號：3181309