纖維小體是附著在部分厭氧微生物細(xì)胞壁外的一種天然多酶復(fù)合體,可以高效催化降解木質(zhì)纖維素,其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性強(qiáng),組裝靈活。目前依靠纖維小體在多種微生物表面實(shí)現(xiàn)了多酶系統(tǒng)的高效聚合,在提高多酶協(xié)同效率方面具有較大的應(yīng)用潛力,但其在細(xì)胞內(nèi)始終無法實(shí)現(xiàn)自組裝。本研究選定纖維小體為胞內(nèi)自組裝體系的基本模型,并選擇其關(guān)鍵元件（對(duì)接蛋白及粘連蛋白）作為主要研究對(duì)象,以大腸桿菌為平臺(tái),著重對(duì)其自組裝機(jī)制進(jìn)行探索與分析,并采用理性設(shè)計(jì)方法對(duì)對(duì)接蛋白進(jìn)行定向改造,再結(jié)合實(shí)驗(yàn)尋找適合在胞內(nèi)組裝的突變方向,并構(gòu)建適用于高通量篩選的流式篩選體系,為以纖維小體為模型的胞內(nèi)自組裝體系的成功構(gòu)建夯實(shí)基礎(chǔ)。研究結(jié)果分為以下三個(gè)方面:（1）選擇已解析出其晶體結(jié)構(gòu)的I型對(duì)接蛋白Doc A和粘連蛋白Coh作為研究對(duì)象,下載其三維結(jié)構(gòu)并用Py MOL等軟件進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)對(duì)接蛋白有2個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)。后將兩蛋白分別在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),再利用分子互作儀對(duì)兩蛋白的結(jié)合機(jī)制進(jìn)行初步探究。研究發(fā)現(xiàn),對(duì)接蛋白和粘連蛋白的穩(wěn)定結(jié)合需要5×10^-4 mol/L左右的鈣離子濃度的參與,當(dāng)鈣離子濃度在0～5×10^-3<... 

【文章來源】：齊魯工業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 引言
    1.2 多酶復(fù)合體
        1.2.1 多酶復(fù)合體簡(jiǎn)介
        1.2.2 胞內(nèi)多酶復(fù)合體的研究現(xiàn)狀
    1.3 天然多酶自組裝體系——纖維小體
        1.3.1 纖維小體簡(jiǎn)介
        1.3.2 熱纖梭菌的纖維小體
        1.3.3 以纖維小體為基礎(chǔ)的催化體系的設(shè)計(jì)進(jìn)展
    1.4 研究的內(nèi)容及意義
        1.4.1 研究?jī)?nèi)容
        1.4.2 研究意義
第2章 自組裝體系的選擇與表達(dá)
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 菌株與質(zhì)粒
        2.2.2 主要試劑
        2.2.3 培養(yǎng)基與溶液
        2.2.4 主要儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 目的蛋白的篩選及獲得
        2.3.2 蛋白DocA-G與蛋白Coh的表達(dá)與純化
        2.3.3 蛋白DocA-G與蛋白Coh結(jié)合機(jī)制的初步探究
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 蛋白Coh與對(duì)接蛋白DocA-G的表達(dá)與純化
        2.4.2 粘連蛋白與對(duì)接蛋白對(duì)接機(jī)制的探究
    2.5 本章小結(jié)
第3章 對(duì)接蛋白的設(shè)計(jì)及驗(yàn)證
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 菌株與質(zhì)粒
        3.2.2 主要試劑
        3.2.3 培養(yǎng)基與溶液
        3.2.4 主要儀器
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 單位點(diǎn)突變體的設(shè)計(jì)及獲得
        3.3.2 雙位點(diǎn)突變體的設(shè)計(jì)及獲得
        3.3.3 對(duì)接突變蛋白的表達(dá)及純化
        3.3.4 突變體與蛋白Coh結(jié)合對(duì)鈣離子依賴性檢測(cè)
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 單位點(diǎn)突變體與蛋白Coh結(jié)合機(jī)制的探究
        3.4.2 雙位點(diǎn)突變體與蛋白Coh結(jié)合機(jī)制的探究
        3.4.3 單、雙位點(diǎn)突變體與蛋白Coh結(jié)合的比較
    3.5 本章小結(jié)
第4章 關(guān)鍵元件-熒光蛋白融合及流式篩選體系構(gòu)建
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 菌株與質(zhì)粒
        4.2.2 主要試劑
        4.2.3 培養(yǎng)基與溶液
        4.2.4 主要儀器
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 表面展示體系的構(gòu)建
        4.3.2 基于兩種熒光信號(hào)的流式篩選體系的初步構(gòu)建
        4.3.3 基于一種熒光信號(hào)的流式篩選體系的初步構(gòu)建
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 表面展示體系的構(gòu)建
        4.4.2 纖維小體元件-熒光蛋白融合構(gòu)建
        4.4.3 基于一種熒光信號(hào)的流式篩選體系的初步構(gòu)建
    4.5 本章小結(jié)
第5章 總結(jié)與展望
    5.1 研究總結(jié)
    5.2 未來展望
參考文獻(xiàn)
致謝
在學(xué)期間主要科研成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]利用SpyTag/SpyCatcher構(gòu)建胞內(nèi)自組裝多酶復(fù)合體實(shí)現(xiàn)高效生物合成[J]. 劉璐,殷亮,黃飛,張勇,劉倩,馮雁.  中國(guó)生物工程雜志. 2018(07)
[2]冰晶核蛋白及其在細(xì)菌表面展示技術(shù)中的應(yīng)用[J]. 李明亞,林陳水.  氨基酸和生物資源. 2016(02)
[3]重組柞蠶抗菌肽AD對(duì)E.coli抗菌機(jī)制研究[J]. 張倩,鄧平建,王興順,李浩,楊小柯,耿藝介.  中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué). 2014(11)
[4]蛹擬青霉液體深層發(fā)酵菌絲體抗氧化活性和抑菌活性分析[J]. 邵穎,陳安徽,陳宏偉.  食品工業(yè). 2011(07)

博士論文
[1]自組裝多酶納米反應(yīng)器的設(shè)計(jì)與構(gòu)建[D]. 殷亮.上海交通大學(xué) 2018
[2]大腸桿菌多酶自組裝合成衣康酸及代謝工程研究[D]. 楊中偉.華東理工大學(xué) 2018
[3]基于纖維小體腳手架蛋白的多酶共展示體系構(gòu)建[D]. 王亮亮.南京林業(yè)大學(xué) 2016



本文編號(hào)：3181309