CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn),推動了生物學(xué)諸多研究領(lǐng)域的快速發(fā)展,近年來在此系統(tǒng)的基礎(chǔ)上又衍生出了CRISPR/d Cas系統(tǒng),該系統(tǒng)在基因表達(dá)水平調(diào)控方面發(fā)揮著巨大的作用。目前幾種基于CRISPR/d Cas9的高效轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)已被開發(fā)用于動物和人體細(xì)胞,然而d Cas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活在植物中的研究卻相對較少且主要集中于雙子葉植物擬南芥中;而且大量的工作著重于鑒定和優(yōu)化d Cas9與激活結(jié)構(gòu)域的融合,對于植物中啟動子區(qū)域向?qū)NA（guide RNA,g RNA）靶位點(diǎn)對轉(zhuǎn)錄激活效率的影響知之甚少。另外,CRISPR/Cpf1系統(tǒng)作為新型的CRISPR/Cas系統(tǒng),它的出現(xiàn)使得基因編輯靶位點(diǎn)的選擇更為豐富,由于脫靶效應(yīng)極低以及cr RNA結(jié)構(gòu)的特異性,CRISPR/d Cpf1系統(tǒng)在多重基因調(diào)控方面更具優(yōu)勢,但是應(yīng)用難度較大,很多研究也處于探索階段。本課題從CRISPR/d Cas9入手,開展水稻中的轉(zhuǎn)錄激活研究。首先我們構(gòu)建了第二代的d Cas9-SAM系統(tǒng),并對其在水稻中的轉(zhuǎn)錄激活效果進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)其激活效率不理想。因此我們又選擇了在植物原生質(zhì)體中被證明轉(zhuǎn)錄激活效率較高的d ... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
1.前言
    1.1 研究問題的由來
    1.2 文獻(xiàn)綜述
        1.2.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的概述
        1.2.2 CRISPR/d Cas9 系統(tǒng)的研究進(jìn)展
        1.2.3 基于CRISPR/d Cas9 轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)的研究進(jìn)展
            1.2.3.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的研究進(jìn)展
            1.2.3.2 不同轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)的應(yīng)用
        1.2.4 CRISPR/Cpf1 系統(tǒng)的概述
        1.2.5 CRISPR/d Cas9 轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)中g(shù) RNA設(shè)計(jì)問題
        1.2.6 轉(zhuǎn)錄激活報告基因
            1.2.6.1 OsWOX11基因功能概述
            1.2.6.2 OsYUC1基因功能概述
    1.3 研究的目的和意義
2.材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌種及質(zhì)粒
        2.1.3 基因的序列信息及登錄號
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 轉(zhuǎn)錄激活載體的構(gòu)建
        2.2.2 陽性克隆的篩選
        2.2.3 遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.4 水稻總DNA抽提
        2.2.5 RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄以及q RT-PCR
3.結(jié)果與分析
    3.1 d Cas9-SAM轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)在水稻中的探索
        3.1.1 d Cas9-SAM系統(tǒng)的構(gòu)建與驗(yàn)證
        3.1.2 d Cas9-SAM轉(zhuǎn)化植株的陽性鑒定及表型考察
        3.1.3 d Cas9-SAM轉(zhuǎn)化植株的表達(dá)量檢測
    3.2 d Cas9-TV轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)在水稻中的探索
        3.2.1 d Cas9-TV系統(tǒng)的優(yōu)化與驗(yàn)證
        3.2.2 d Cas9-TV轉(zhuǎn)化植株的陽性鑒定及表型考察
        3.2.3 d Cas9-TV轉(zhuǎn)化植株的表達(dá)量檢測
    3.3 最佳gRNA靶向區(qū)域的探索
    3.4 dCpf1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)在水稻中的初步探索
4.討論
    4.1 dCas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)適應(yīng)性及效率分析
    4.2 轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)的策略分析
    4.3 存在問題及未來研究方向
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄A 本研究所用到引物信息
    附錄B 部分實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)操作步驟
        B1 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化
        B2 TIANGENG DNA試劑盒純化回收
        B3 感受態(tài)細(xì)胞的制備
    附錄C 在讀期間研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Self-cleaving ribozymes enable the production of guide RNAs from unlimited choices of promoters for CRISPR/Cas9 mediated genome editing[J]. Yubing He,Tao Zhang,Ning Yang,Meilian Xu,Lang Yan,Lihao Wang,Rongchen Wang,Yunde Zhao.  Journal of Genetics and Genomics. 2017(09)



本文編號：3167296