[目的]構(gòu)建攜帶小鼠Dok5基因及其PH、PTB結(jié)構(gòu)域的原核表達載體,并表達對應GST融合蛋白。[方法]從小鼠腦組織提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后經(jīng)PCR擴增、酶切、連接及轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,構(gòu)建攜帶Dok5全長（FL）、PTB、PH結(jié)構(gòu)域的原核表達質(zhì)粒,經(jīng)酶切及測序鑒定之后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)IPTG誘導表達蛋白,再利用Glutathion Sepharose 4B親和層析柱純化得到融合蛋白,并通過Western Blotting檢測其與相應抗體的反應性。利用生物信息學相關(guān)軟件（ClustalW2、ProtParam、ProtScale、NetPhos 2.0 Server、SOPMA、Swissmodel）預測Dok5蛋白的理化性質(zhì)和磷酸化位點以及二、三級結(jié)構(gòu)。[結(jié)果]構(gòu)建了小鼠Dok5 FL、PH、PTB的原核表達質(zhì)粒,并得到了濃度分別為0.3 mg/ml、0.6 mg/mL、1 mg/mL的pGEX 6p-1-Dok5 FL、PH、PTB蛋白,其中Dok5 FL融合蛋白與相應抗體具有良好的反應性。Dok5長度為921 bp,編碼306個氨基酸,在人、鼠、猴中高度保守。Dok5相... 

【文章來源】：生物技術(shù). 2020,30(02)

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p GEX6p-1 Dok5質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

Dok5是作為受體型酪氨酸蛋白激酶c-Ret的底物而被發(fā)現(xiàn)的，它與c-Ret在多種神經(jīng)組織中共表達，介導神經(jīng)元的分化[8]。在結(jié)構(gòu)上，Cai D等對Dok5氨基酸序列的分析發(fā)現(xiàn)Dok5與胰島素受體底物結(jié)構(gòu)相似，都具有PH-PTB Domain，因此將其命名為IRS6[17]。蛋白的結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮生物學功能的關(guān)鍵。Dok蛋白的三個結(jié)構(gòu)域中，PH結(jié)構(gòu)域可與磷脂酰肌醇結(jié)合，介導與胞膜的相互作用，在靶向質(zhì)膜的過程中至關(guān)重要[18]。PTB域是蛋白有選擇性地結(jié)合RTK的重要結(jié)構(gòu)[19],C末端是Dok下游信號蛋白結(jié)合的區(qū)域。其中，Dok5的PTB結(jié)構(gòu)域更受關(guān)注。Shi L等通過酵母雙雜交實驗證明，Dok5可以通過其PTB結(jié)構(gòu)域，以激酶活性依賴的方式與Trk受體NPQY基序結(jié)合，并且與N-shc競爭結(jié)合同一位點[11]。閻志勇等利用pGEX4T-3原核表達系統(tǒng)純化得到了Dok5 PTB結(jié)構(gòu)域的融合蛋白[20]。本研究與其方法相似，所用表達載體為p GEX6p-1，同樣獲得了Dok5 PTB蛋白，并且同時得到了Dok5全長和PH結(jié)構(gòu)域蛋白。石寧等通過X晶體衍射分析了其晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Dok5 PTB結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)與胰島素受體底物(IRS1)很相似，都是由一個緊密的7β片層三明治和一個C末端的長α螺旋組成，該結(jié)構(gòu)是PTB結(jié)構(gòu)域識別底物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[15]。其對Dok5PTB結(jié)構(gòu)域的研究更為深入，晶體結(jié)構(gòu)雖然不能代表蛋白在生理條件下的天然結(jié)構(gòu)，但是對Dok5蛋白結(jié)構(gòu)的解析依然具有重要指示意義。Dok5 C端也具有多個酪氨酸磷酸化位點，目前尚不清楚Dok5 C端在介導的信號傳遞中的作用機制。由于C端富含疏水性氨基酸，在BL21中不易正確折疊，導致形成包涵體結(jié)構(gòu)，難以獲得C端的融合蛋白，這也是本研究的不足之處。潘艷芳等比對了人和小鼠的Dok5氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其高度相似[12]，本研究增加了恒河猴氨基酸序列的比對，一致性達到了99.35%。其中，PTB結(jié)構(gòu)域氨基酸序列完全一致，提示PTB域在細胞信號轉(zhuǎn)導過程中可能通過相似的方式傳遞信號。相對而言，C端的差異較大，人和猴的C端有1個氨基酸的差異，和小鼠共有5個氨基酸不同，提示C端在下游信號傳遞中可能采用不同的模式，并與氨基酸位點的磷酸化相關(guān)。目前，Dok5的功能和發(fā)揮功能的機制還不清楚，需要進一步研究。圖3 Dok5 FL/PH/PTB融合蛋白在BL21中的溶解性分析和純化鑒定

Dok5 FL/PH/PTB融合蛋白在BL21中的溶解性分析和純化鑒定

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Dok5基因3’非編碼區(qū)（3’UTR）的多態(tài)性與我國漢族2型糖尿病關(guān)系的初步研究[J]. 劉雪梅,朱麗媛,安芳,朱惠娟,彭小忠,潘慧.  中國衛(wèi)生檢驗雜志. 2014(14)
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博士論文
[1]神經(jīng)元分化相關(guān)蛋白Dok5和MAP1B的功能研究[D]. 花芳.中國協(xié)和醫(yī)科大學 2005
[2]兩種DOK蛋白PTB結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能的研究[D]. 石寧.中國協(xié)和醫(yī)科大學 2003

碩士論文
[1]Dok5促進GDNF誘導PC12-GFRa1-RET細胞分化[D]. 仇海燕.青島大學 2004



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