[目的]構(gòu)建攜帶小鼠Dok5基因及其PH、PTB結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)載體,并表達(dá)對(duì)應(yīng)GST融合蛋白。[方法]從小鼠腦組織提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切、連接及轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,構(gòu)建攜帶Dok5全長（FL）、PTB、PH結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定之后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,再利用Glutathion Sepharose 4B親和層析柱純化得到融合蛋白,并通過Western Blotting檢測(cè)其與相應(yīng)抗體的反應(yīng)性。利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件（ClustalW2、ProtParam、ProtScale、NetPhos 2.0 Server、SOPMA、Swissmodel）預(yù)測(cè)Dok5蛋白的理化性質(zhì)和磷酸化位點(diǎn)以及二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。[結(jié)果]構(gòu)建了小鼠Dok5 FL、PH、PTB的原核表達(dá)質(zhì)粒,并得到了濃度分別為0.3 mg/ml、0.6 mg/mL、1 mg/mL的pGEX 6p-1-Dok5 FL、PH、PTB蛋白,其中Dok5 FL融合蛋白與相應(yīng)抗體具有良好的反應(yīng)性。Dok5長度為921 bp,編碼306個(gè)氨基酸,在人、鼠、猴中高度保守。Dok5相... 

【文章來源】：生物技術(shù). 2020,30(02)

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p GEX6p-1 Dok5質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

Dok5是作為受體型酪氨酸蛋白激酶c-Ret的底物而被發(fā)現(xiàn)的，它與c-Ret在多種神經(jīng)組織中共表達(dá)，介導(dǎo)神經(jīng)元的分化[8]。在結(jié)構(gòu)上，Cai D等對(duì)Dok5氨基酸序列的分析發(fā)現(xiàn)Dok5與胰島素受體底物結(jié)構(gòu)相似，都具有PH-PTB Domain，因此將其命名為IRS6[17]。蛋白的結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵。Dok蛋白的三個(gè)結(jié)構(gòu)域中，PH結(jié)構(gòu)域可與磷脂酰肌醇結(jié)合，介導(dǎo)與胞膜的相互作用，在靶向質(zhì)膜的過程中至關(guān)重要[18]。PTB域是蛋白有選擇性地結(jié)合RTK的重要結(jié)構(gòu)[19],C末端是Dok下游信號(hào)蛋白結(jié)合的區(qū)域。其中，Dok5的PTB結(jié)構(gòu)域更受關(guān)注。Shi L等通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明，Dok5可以通過其PTB結(jié)構(gòu)域，以激酶活性依賴的方式與Trk受體NPQY基序結(jié)合，并且與N-shc競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合同一位點(diǎn)[11]。閻志勇等利用pGEX4T-3原核表達(dá)系統(tǒng)純化得到了Dok5 PTB結(jié)構(gòu)域的融合蛋白[20]。本研究與其方法相似，所用表達(dá)載體為p GEX6p-1，同樣獲得了Dok5 PTB蛋白，并且同時(shí)得到了Dok5全長和PH結(jié)構(gòu)域蛋白。石寧等通過X晶體衍射分析了其晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Dok5 PTB結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)與胰島素受體底物(IRS1)很相似，都是由一個(gè)緊密的7β片層三明治和一個(gè)C末端的長α螺旋組成，該結(jié)構(gòu)是PTB結(jié)構(gòu)域識(shí)別底物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[15]。其對(duì)Dok5PTB結(jié)構(gòu)域的研究更為深入，晶體結(jié)構(gòu)雖然不能代表蛋白在生理?xiàng)l件下的天然結(jié)構(gòu)，但是對(duì)Dok5蛋白結(jié)構(gòu)的解析依然具有重要指示意義。Dok5 C端也具有多個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，目前尚不清楚Dok5 C端在介導(dǎo)的信號(hào)傳遞中的作用機(jī)制。由于C端富含疏水性氨基酸，在BL21中不易正確折疊，導(dǎo)致形成包涵體結(jié)構(gòu)，難以獲得C端的融合蛋白，這也是本研究的不足之處。潘艷芳等比對(duì)了人和小鼠的Dok5氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其高度相似[12]，本研究增加了恒河猴氨基酸序列的比對(duì)，一致性達(dá)到了99.35%。其中，PTB結(jié)構(gòu)域氨基酸序列完全一致，提示PTB域在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中可能通過相似的方式傳遞信號(hào)。相對(duì)而言，C端的差異較大，人和猴的C端有1個(gè)氨基酸的差異，和小鼠共有5個(gè)氨基酸不同，提示C端在下游信號(hào)傳遞中可能采用不同的模式，并與氨基酸位點(diǎn)的磷酸化相關(guān)。目前，Dok5的功能和發(fā)揮功能的機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步研究。圖3 Dok5 FL/PH/PTB融合蛋白在BL21中的溶解性分析和純化鑒定

Dok5 FL/PH/PTB融合蛋白在BL21中的溶解性分析和純化鑒定

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Dok5基因3’非編碼區(qū)（3’UTR）的多態(tài)性與我國漢族2型糖尿病關(guān)系的初步研究[J]. 劉雪梅,朱麗媛,安芳,朱惠娟,彭小忠,潘慧.  中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志. 2014(14)
[2]Dok4和Dok5 PTB結(jié)構(gòu)域融合蛋白的表達(dá)和純化[J]. 閻志勇,吳愛群,張勇,由振東,路長林,周明明,何成.  河南醫(yī)學(xué)研究. 2003(02)

博士論文
[1]神經(jīng)元分化相關(guān)蛋白Dok5和MAP1B的功能研究[D]. 花芳.中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 2005
[2]兩種DOK蛋白PTB結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能的研究[D]. 石寧.中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 2003

碩士論文
[1]Dok5促進(jìn)GDNF誘導(dǎo)PC12-GFRa1-RET細(xì)胞分化[D]. 仇海燕.青島大學(xué) 2004



本文編號(hào)：3145837