大腸桿菌是基因工程領(lǐng)域中使用最廣泛的表達(dá)宿主菌之一,在發(fā)酵過程中存在雜菌污染和噬菌體侵染的問題,目前仍缺乏有效的解決策略。為解決上述問題,本研究以大腸桿菌為研究對象,旨在構(gòu)建一株能抗雜菌污染和噬菌體侵染的加強型大腸桿菌工程菌。在大腸桿菌中增加兩條新的稀有氮磷源代謝途徑（抗雜菌系統(tǒng)）,其表達(dá)的甲酰胺酶與亞磷酸脫氫酶能專一性催化甲酰胺和亞磷酸鹽分別成為銨根離子和磷酸鹽作為大腸桿菌生長的氮源和磷源,以防止雜菌污染。在此基礎(chǔ)上引入抗噬菌體系統(tǒng)（CRISPR/Cas9）,賦予大腸桿菌工程菌抵抗噬菌體的能力。構(gòu)建得到的具有雙保護(hù)系統(tǒng)的加強型大腸桿菌工程菌將具有非常巨大的應(yīng)用潛力。本課題組通過對具有自主知識產(chǎn)權(quán)的類芽孢桿菌Paenibacillus pasadenensis CS0611的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該菌的基因組中含有甲酰胺酶基因,并利用PCR技術(shù)擴增得到了該基因的全長序列;另外,通過菌種篩選得到一株能利用亞磷酸鹽的肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae strain OU07,并成功克隆了亞磷酸脫氫酶基因的全長序列。詳細(xì)地分析了兩種酶基因及對應(yīng)蛋白的序列信息和催化結(jié)構(gòu),發(fā)... 

【文章來源】：華南理工大學(xué)廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

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CRISPR結(jié)構(gòu)示意圖

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的改造

第一章緒論15和噬菌體侵染導(dǎo)致的發(fā)酵失敗已屢見不鮮，發(fā)酵罐或培養(yǎng)基滅菌不徹底、空氣過濾系統(tǒng)故障等因素都有可能導(dǎo)致大腸桿菌發(fā)酵失敗。一旦發(fā)酵失敗，只能做倒灌處理，不僅造成巨大的經(jīng)濟損失和原料浪費，而且還會污染生態(tài)環(huán)境。因此，如何從根本上控制雜菌污染和噬菌體侵染是一項具有重要實際意義的挑戰(zhàn)性難題。圖1-6加強型大腸桿菌的構(gòu)建原理圖Fig.1-6SchematicdiagramoftheconstructionoftherobustEscherichiacoliBL21(DE3)strain本研究以大腸桿菌宿主細(xì)胞作為研究對象，旨在構(gòu)建一株能抗雜菌污染和噬菌體侵染的加強型大腸桿菌工程菌。通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)甲酰胺酶能專一性水解甲酰胺成為銨根離子，而酰胺酶的底物特異性比較寬，能水解乙酰胺、丙酰胺、丁酰胺、異丁酰胺等[89]，且在NCBI數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)甲酰胺酶的數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于酰胺酶的數(shù)量，這對構(gòu)建稀有代謝途徑來降低染菌概率是非常有利的。此外，亞磷酸脫氫酶能專一性氧化亞磷酸鹽成為磷酸鹽，并且目前發(fā)現(xiàn)的亞磷酸脫氫酶數(shù)量少，只有3829條，且只存在于細(xì)菌中。迄今為止，還沒有發(fā)現(xiàn)能同時分泌甲酰胺酶和亞磷酸脫氫酶的微生物。所以，在大腸桿菌工程菌中增加這兩條新的稀有氮源和磷源代謝途徑，其表達(dá)的甲酰胺酶與亞磷酸脫氫酶能專一性催化小分子甲酰胺和亞磷酸鹽成為銨根離子和正價磷酸鹽分別作為大腸桿菌生長的氮源和磷源。以這兩條稀有代謝途徑作為抗雜菌系統(tǒng)，可有效降低雜菌污染的概率。在此基礎(chǔ)上引入抗噬菌體系統(tǒng)（CRISPR/Cas9）的質(zhì)粒，賦予大腸桿菌工程菌抵抗T7噬菌體的能力。經(jīng)改造的加強型大腸桿菌優(yōu)勢工程菌具有非常巨大的應(yīng)用潛力，一方面保證工程菌正常生長繁殖并表達(dá)質(zhì)粒上的目標(biāo)基因，另一方面能在未滅菌培養(yǎng)基和開放式的發(fā)酵罐中進(jìn)行安全發(fā)酵生產(chǎn)的同?

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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