m⁶A修飾是mRNA中最為普遍的化學(xué)修飾,在它的調(diào)控蛋白writers、erasers、readers的作用下發(fā)揮重要的功能,m⁶A修飾因其廣泛的存在mRNAs中而正在被研究。它的動態(tài)調(diào)節(jié)過程能夠影響到細(xì)胞的增殖與分化、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、一些人類疾病的發(fā)生、mRNAs的局部翻譯,以及神經(jīng)系統(tǒng)行使正常的生理功能等。本課題之前的研究表明,神經(jīng)元軸突中去甲基化反應(yīng)被抑制,會導(dǎo)致mRNAs上的m⁶A水平的維持或者升高,進(jìn)而導(dǎo)致軸突中mRNAs的翻譯被抑制。mRNAs在軸突中進(jìn)行局部翻譯之前,必須首先要轉(zhuǎn)運(yùn)與定位到軸突中,m⁶A修飾是否能夠通過其閱讀蛋白參與調(diào)控mRNAs的轉(zhuǎn)運(yùn)與定位目前還不清楚。神經(jīng)元作為一種高度極化的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),是在核外研究m⁶A修飾的功能、以及m⁶A修飾對于m RNA在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)特別是軸突中的轉(zhuǎn)運(yùn)與定位的理想模型系統(tǒng)。圍繞著這個(gè)目的,本課題探索了有效收集大量軸突RNAs的方法,建立體外敲低m⁶A修飾相關(guān)基因的系統(tǒng)。本課題將使... 

【文章來源】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

N6-甲基化腺苷酸結(jié)構(gòu)示意圖[1]

的結(jié)合成分，并且它能夠獨(dú)立展現(xiàn)出催化作用[21,22]。在Mettl3基因敲除的小鼠中，幾乎導(dǎo)致了囊胚（blastocysts）mRNA中的m6A修飾完全缺失，這說明了METTL3蛋白在m6A修飾中的重要作用[26]。這些結(jié)果證明了METTL3是mRNAm6A修飾中的甲基轉(zhuǎn)移酶。早期的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)提取物中存在有甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性，而且也有很多研究表明METTL3蛋白在細(xì)胞核以及細(xì)胞質(zhì)中均有被觀察到，這些共同說明了mRNA的m6A甲基化可能是發(fā)生在細(xì)胞核或者是細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中[14,27,28]。METTL14與METTL3是相近的同源類似物，經(jīng)純化得到的METTL14也能夠圖1-2m6A甲基化與去甲基化反應(yīng)[3]

哈爾濱工業(yè)大學(xué)工程碩士論文-12-通過促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)流動加速RNPs與錨（anchors）的相互作用，比如在Drosophila卵子發(fā)生后期nanosmRNAs的定位[108]。一些mRNAs的轉(zhuǎn)運(yùn)過程復(fù)合物的列子如圖1-3所示。一旦RNPs到達(dá)了它的目的地，通常它們就可能會被重塑，mRNA被錨定，然后錨定因子會取代轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，翻譯因子會取代翻譯抑制因子，通常不同mRNA的錨定方式會有很大不同[109]。比如，Xenopus的Vg1RNP在細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中被重塑[110]。Vg1mRNA在vegetalcortex的錨定需要依賴微絲（microfilaments）的協(xié)助[111]。在Drosophilablastodermembryos中也發(fā)現(xiàn)一個(gè)靜止的動力蛋白的錨能夠錨定成對（pair-rule）的轉(zhuǎn)錄本[112]。因此在運(yùn)輸mRNA復(fù)合物的后期，動力蛋白也許是往一個(gè)靜態(tài)的靶向錨的方向運(yùn)輸。在神經(jīng)元中，不正常的mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)與定位會引起嚴(yán)重的生理缺陷，導(dǎo)致神經(jīng)性退化，但是具體是由哪些mRNA的錯誤轉(zhuǎn)運(yùn)與定位引起的，我們還未知。類似的情況還有很多，雖然我們對RNA轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物以及轉(zhuǎn)運(yùn)方式已經(jīng)有一些了解，但是對于大部分的mRNA的RNPs的內(nèi)容物以及轉(zhuǎn)運(yùn)方式還不了解，還需要我們更加深入研究。1.4微流控芯片的介紹以及研究進(jìn)展1.4.1微流控技術(shù)簡介微流控（microfluidics）是一項(xiàng)能夠以幾到幾百微米的調(diào)節(jié)精度對流體、顆粒等進(jìn)行精細(xì)操作的技術(shù)[113]。微流控也被認(rèn)為是生物醫(yī)學(xué)或者化學(xué)應(yīng)用的一個(gè)平臺，叫做芯片上的實(shí)驗(yàn)室（Lab-on-a-Chip，LOC），也被稱為微全分析系統(tǒng)（microTotalAnalysisSystems，μTAS）[114]。由于微流控技術(shù)對生物顆粒分子、以及細(xì)胞周圍微圖1-3一些mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物的例子[2]


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