非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)利用外源的非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶（aaRS）基因和對應的tRNA基因構(gòu)建非天然氨基酸正交翻譯系統(tǒng)（Orthogonal translation system）。該正交翻譯系統(tǒng)能利用終止密碼子在蛋白翻譯過程中將非天然氨基酸定點插入目標多肽鏈中。該技術(shù)不但是一種新的蛋白質(zhì)生化研究工具,在新型基因工程病毒疫苗研究中更具有劃時代的意義。利用人為構(gòu)建的具有非天然氨基酸正交翻譯系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因細胞,通過在病毒復制的關(guān)鍵基因中引入提前終止密碼子構(gòu)建的突變病毒,在添加非天然氨基酸的情況下該基因仍能完整表達從而完成病毒的復制和傳代,但該突變病毒在正常細胞（無非天然氨基酸正交翻譯系統(tǒng)的宿主細胞）中因復制關(guān)鍵基因不能完整表達而無法復制傳代,因而是一種復制缺陷型病毒。這種復制缺陷型病毒用作疫苗時兼具了減毒活疫苗免疫效果良好與滅活疫苗安全性高的優(yōu)點,是一種較為理想的活病毒疫苗。文中簡要綜述了非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)在新型復制缺陷活病毒疫苗研究中的應用及其前景。 

【文章來源】：生物工程學報. 2020,36(05)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)制備復制缺陷型流感病毒的原理

絕大多數(shù)蛋白質(zhì)是由20種天然蛋白氨基酸構(gòu)成的，因此我們對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究當然會受到這20種氨基酸的限制。而利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)在原核生物或真核生物蛋白質(zhì)中定點引入非天然氨基酸無疑為蛋白質(zhì)的生物化學研究和蛋白質(zhì)操縱提供了全新的技術(shù)手段。非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)最直接的應用就是利用具有特定生物正交反應性質(zhì)的非天然氨基酸在活細胞中對蛋白質(zhì)進行標記，這對目標蛋白功能研究具有巨大的工具意義[16]。如有研究者將合成含有脂肪族疊氮化合物和/或烷基化合物的吡咯賴氨酸類似物定點插入蛋白質(zhì)后通過“點擊”化學修飾高效地進行蛋白標記[17]。將顯色基團與插入目標蛋白的UAAs耦合后可用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學的光譜分析[18]。熒光基團與蛋白質(zhì)上的UAAs偶聯(lián)使探針與目標之間的距離最小化，為超分辨率顯微鏡的觀察提供便利[19]。也有研究將光親和性非天然氨基酸插入目標蛋白作為質(zhì)譜識別標簽，顯著提高了對蛋白質(zhì)相互作用的識別靈敏度[20]。賴氨酸乙�；且环N蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，它和蛋白質(zhì)磷酸化一樣對真核細胞具有重要的調(diào)控意義。有研究利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)通過大腸桿菌制備了插入Ne-乙酰基賴氨酰酸的重組蛋白，為蛋白質(zhì)乙酰化的細胞功能研究提供了新的手段[21]。除了在蛋白質(zhì)基礎(chǔ)研究中具有多種應用外，非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)在應用性研究中也展露出巨大的潛力。有研究利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)引入UAAs以開發(fā)新型蛋白藥物(如抗體和激素)，或?qū)⒉迦肓朔翘烊话被岬目贵w通過非天然氨基酸與細胞毒性藥物偶聯(lián)物以靶向癌細胞[22-23]。此外，通過非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)在酶中引入UAAs提高酶活或控制酶活在工業(yè)領(lǐng)域和醫(yī)藥領(lǐng)域均具有應用開發(fā)潛力[24]。下文將簡要綜述非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)在新型基因工程活病毒疫苗研究中的應用和前景。

北京大學周德敏課題組在一項研究中構(gòu)建了幾十個在不同基因的不同位置含有提前終止密碼子的PTC流感病毒的感染性克隆，然后利用含有MbpylRS/tRNACUA正交對的轉(zhuǎn)基因293T細胞并通過添加非天然氨基酸Ne-2-azidoethyloxycarbonylL-lysine(NAEK)制備了復制缺陷型流感病毒(圖3)[35]。研究結(jié)果顯示構(gòu)建的絕大部分PTC流感病毒都只能在添加NAEK的轉(zhuǎn)基因細胞中復制，在非轉(zhuǎn)基因細胞或不添加NAEK的轉(zhuǎn)基因細胞中均不能復制，證實了制備的復制缺陷型流感病毒對正常細胞的安全性。該研究進一步對一株含有4個提前終止密碼子(PA-R266、PB2-K33、PB1-R52、NP-D101)的復制缺陷型流感病毒PTC-4A作為候選疫苗株進行了深入的研究，同株野生型病毒對小鼠的LD50為8×103 PFU，而小鼠攻毒試驗證實用109 PFU的PTC-4A進行攻毒后10只小鼠無一發(fā)病或死亡。在105 PFU攻毒劑量下，PTC-4A株與CIAV株(商品化的冷適應弱毒疫苗株)相比無論是體重情況和第3天組織帶毒量均明顯優(yōu)于CIAV株，證實了PTC-4A株的安全性優(yōu)于常規(guī)的弱毒疫苗株。在免疫效力方面，小鼠免疫實驗證實PTC-4A株與CIAV株相比在HI抗體滴度、NT抗體滴度、IgA抗體滴度和特異性CD8+T細胞反應各方面均無顯著差異，但顯著優(yōu)于滅活疫苗。小鼠免疫保護實驗證實在兩次免疫和50倍LD50攻毒情況下，PTC-4A株與CIAV株免疫小鼠存活率均為100%，而滅活疫苗免疫小鼠的存活率只有70%。圖3 利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)制備復制缺陷型流感病毒的原理


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