非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)利用外源的非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶（aaRS）基因和對(duì)應(yīng)的tRNA基因構(gòu)建非天然氨基酸正交翻譯系統(tǒng)（Orthogonal translation system）。該正交翻譯系統(tǒng)能利用終止密碼子在蛋白翻譯過(guò)程中將非天然氨基酸定點(diǎn)插入目標(biāo)多肽鏈中。該技術(shù)不但是一種新的蛋白質(zhì)生化研究工具,在新型基因工程病毒疫苗研究中更具有劃時(shí)代的意義。利用人為構(gòu)建的具有非天然氨基酸正交翻譯系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,通過(guò)在病毒復(fù)制的關(guān)鍵基因中引入提前終止密碼子構(gòu)建的突變病毒,在添加非天然氨基酸的情況下該基因仍能完整表達(dá)從而完成病毒的復(fù)制和傳代,但該突變病毒在正常細(xì)胞（無(wú)非天然氨基酸正交翻譯系統(tǒng)的宿主細(xì)胞）中因復(fù)制關(guān)鍵基因不能完整表達(dá)而無(wú)法復(fù)制傳代,因而是一種復(fù)制缺陷型病毒。這種復(fù)制缺陷型病毒用作疫苗時(shí)兼具了減毒活疫苗免疫效果良好與滅活疫苗安全性高的優(yōu)點(diǎn),是一種較為理想的活病毒疫苗。文中簡(jiǎn)要綜述了非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)在新型復(fù)制缺陷活病毒疫苗研究中的應(yīng)用及其前景。 

【文章來(lái)源】：生物工程學(xué)報(bào). 2020,36(05)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【部分圖文】：

利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)制備復(fù)制缺陷型流感病毒的原理

絕大多數(shù)蛋白質(zhì)是由20種天然蛋白氨基酸構(gòu)成的，因此我們對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究當(dāng)然會(huì)受到這20種氨基酸的限制。而利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)在原核生物或真核生物蛋白質(zhì)中定點(diǎn)引入非天然氨基酸無(wú)疑為蛋白質(zhì)的生物化學(xué)研究和蛋白質(zhì)操縱提供了全新的技術(shù)手段。非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)最直接的應(yīng)用就是利用具有特定生物正交反應(yīng)性質(zhì)的非天然氨基酸在活細(xì)胞中對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，這對(duì)目標(biāo)蛋白功能研究具有巨大的工具意義[16]。如有研究者將合成含有脂肪族疊氮化合物和/或烷基化合物的吡咯賴氨酸類似物定點(diǎn)插入蛋白質(zhì)后通過(guò)“點(diǎn)擊”化學(xué)修飾高效地進(jìn)行蛋白標(biāo)記[17]。將顯色基團(tuán)與插入目標(biāo)蛋白的UAAs耦合后可用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的光譜分析[18]。熒光基團(tuán)與蛋白質(zhì)上的UAAs偶聯(lián)使探針與目標(biāo)之間的距離最小化，為超分辨率顯微鏡的觀察提供便利[19]。也有研究將光親和性非天然氨基酸插入目標(biāo)蛋白作為質(zhì)譜識(shí)別標(biāo)簽，顯著提高了對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的識(shí)別靈敏度[20]。賴氨酸乙�；且环N蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，它和蛋白質(zhì)磷酸化一樣對(duì)真核細(xì)胞具有重要的調(diào)控意義。有研究利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)通過(guò)大腸桿菌制備了插入Ne-乙�；嚢滨Ｋ岬闹亟M蛋白，為蛋白質(zhì)乙�；募�(xì)胞功能研究提供了新的手段[21]。除了在蛋白質(zhì)基礎(chǔ)研究中具有多種應(yīng)用外，非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)在應(yīng)用性研究中也展露出巨大的潛力。有研究利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)引入U(xiǎn)AAs以開(kāi)發(fā)新型蛋白藥物(如抗體和激素)，或?qū)⒉迦肓朔翘烊话被岬目贵w通過(guò)非天然氨基酸與細(xì)胞毒性藥物偶聯(lián)物以靶向癌細(xì)胞[22-23]。此外，通過(guò)非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)在酶中引入U(xiǎn)AAs提高酶活或控制酶活在工業(yè)領(lǐng)域和醫(yī)藥領(lǐng)域均具有應(yīng)用開(kāi)發(fā)潛力[24]。下文將簡(jiǎn)要綜述非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)在新型基因工程活病毒疫苗研究中的應(yīng)用和前景。

北京大學(xué)周德敏課題組在一項(xiàng)研究中構(gòu)建了幾十個(gè)在不同基因的不同位置含有提前終止密碼子的PTC流感病毒的感染性克隆，然后利用含有MbpylRS/tRNACUA正交對(duì)的轉(zhuǎn)基因293T細(xì)胞并通過(guò)添加非天然氨基酸Ne-2-azidoethyloxycarbonylL-lysine(NAEK)制備了復(fù)制缺陷型流感病毒(圖3)[35]。研究結(jié)果顯示構(gòu)建的絕大部分PTC流感病毒都只能在添加NAEK的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中復(fù)制，在非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或不添加NAEK的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中均不能復(fù)制，證實(shí)了制備的復(fù)制缺陷型流感病毒對(duì)正常細(xì)胞的安全性。該研究進(jìn)一步對(duì)一株含有4個(gè)提前終止密碼子(PA-R266、PB2-K33、PB1-R52、NP-D101)的復(fù)制缺陷型流感病毒PTC-4A作為候選疫苗株進(jìn)行了深入的研究，同株野生型病毒對(duì)小鼠的LD50為8×103 PFU，而小鼠攻毒試驗(yàn)證實(shí)用109 PFU的PTC-4A進(jìn)行攻毒后10只小鼠無(wú)一發(fā)病或死亡。在105 PFU攻毒劑量下，PTC-4A株與CIAV株(商品化的冷適應(yīng)弱毒疫苗株)相比無(wú)論是體重情況和第3天組織帶毒量均明顯優(yōu)于CIAV株，證實(shí)了PTC-4A株的安全性優(yōu)于常規(guī)的弱毒疫苗株。在免疫效力方面，小鼠免疫實(shí)驗(yàn)證實(shí)PTC-4A株與CIAV株相比在HI抗體滴度、NT抗體滴度、IgA抗體滴度和特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)各方面均無(wú)顯著差異，但顯著優(yōu)于滅活疫苗。小鼠免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)在兩次免疫和50倍LD50攻毒情況下，PTC-4A株與CIAV株免疫小鼠存活率均為100%，而滅活疫苗免疫小鼠的存活率只有70%。圖3 利用非天然氨基酸正交翻譯技術(shù)制備復(fù)制缺陷型流感病毒的原理


本文編號(hào)：3139385