聚焦離子束連續(xù)切片掃描電鏡（focused ion beam serial block face scanning electron microscopy,FIB-SEM）技術(shù),目前已被廣泛應(yīng)用于小體積細(xì)胞或組織樣品的三維重構(gòu),具有自動(dòng)化程度高、Z軸分辨高等優(yōu)點(diǎn)。本文從包埋塊樣品準(zhǔn)備與處理、樣品區(qū)域選定、軟件設(shè)置前準(zhǔn)備、軟件參數(shù)（離子束加工和電子束掃描）設(shè)置、軟件運(yùn)行與圖像采集和圖像處理等多個(gè)方面,詳細(xì)介紹應(yīng)用FIB-SEM技術(shù)對(duì)常溫生物包埋塊樣品進(jìn)行三維重構(gòu)的流程和細(xì)節(jié),并對(duì)某些關(guān)鍵性參數(shù)展開討論。 

【文章來源】：電子顯微學(xué)報(bào). 2020,39(02)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：10 頁

【部分圖文】：

固定在預(yù)傾樣品臺(tái)上的樹脂包埋塊。修好的樹脂塊通過導(dǎo)電膠水粘到預(yù)傾樣品臺(tái)上。

將樣品放入雙束掃描電鏡的艙室內(nèi),待真空抽到(3～4)×10-3 Pa,開始加熱離子源。在等待加熱的幾分鐘內(nèi),可先在電子束下找到修好的樣品部分,并通過旋轉(zhuǎn)樣品臺(tái)的方式使樣品觀察面和上表面的相交線保持水平狀態(tài)(如圖2所示),將樣品觀察面升至該電鏡推薦的雙束工作距離—4 mm。待離子束加熱完成,在離子束成像界面再次調(diào)整樣品臺(tái)的旋轉(zhuǎn)位置,最終以離子束成像時(shí),上表面和樣品觀察面相交線呈水平狀態(tài)為準(zhǔn);隨后傾轉(zhuǎn)樣品臺(tái),使得樣品觀察面平行于離子束流(根據(jù)修塊的情況而定,通常對(duì)于45°預(yù)傾臺(tái)上的樣品塊,需要傾轉(zhuǎn)5°～10°);調(diào)整工作距離(Z軸高度),使得在電子束和離子束下觀察到樣品的同一區(qū)域,此時(shí)可以保存樣品臺(tái)位置,將其標(biāo)記為“FIB”。圖3 樹脂塊上表面(FIB成像面)。

圖2 樣品區(qū)域的選定和加工。由于樣品表面經(jīng)過噴金或噴碳的導(dǎo)電處理,因此無法直接觀察到樣品的表面區(qū)域,需要首先用離子束流對(duì)其進(jìn)行粗修加工,暴露出樣品面。對(duì)于本文討論的實(shí)驗(yàn)流程,一般選擇最大的加速電壓30 kV,此時(shí)具有最佳的光斑尺寸,加工效率也比較高。如果目標(biāo)樣品區(qū)域非常貼近樣品塊的表面,為避免在不可逆的粗修過程中加工掉目標(biāo)區(qū)域,可以選擇略小的離子束束流進(jìn)行表面的精修,如2.5 nA;如果目標(biāo)樣品區(qū)域離表面較遠(yuǎn),為提高效率,則可選擇略大的離子束束流,如9.3 nA或者21 nA。在加工的過程中,需要隨時(shí)在電子束下成像檢查,觀察目標(biāo)樣品區(qū)的暴露情況;必要時(shí)可中斷減薄過程,傾轉(zhuǎn)樣品臺(tái)使得電子束垂直于觀察樣品區(qū)域,進(jìn)行精細(xì)成像(模式二,TLD探頭,背散射電子成像,短工作距離2 mm),最終確定理想的樣品成像區(qū)域,此時(shí)再次保存樣品臺(tái)位置,可命名為“SEM”。對(duì)于上述情況的后者,在選定樣品區(qū)域步驟需要花費(fèi)較多的時(shí)間。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]FIB-SEM雙束技術(shù)簡(jiǎn)介及其部分應(yīng)用介紹[J]. 付琴琴,單智偉.  電子顯微學(xué)報(bào). 2016(01)



本文編號(hào)：3137683