目的根據(jù)IRES末端序列的不同,構(gòu)建4個(gè)GFP表達(dá)強(qiáng)度不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,為后續(xù)流式檢測或成像提供基礎(chǔ)。方法利用腦心肌炎病毒IRES的轉(zhuǎn)錄效率依賴于其末端的基因序列,通過重疊PCR方法將IRES與EGFP融合成4個(gè)不同連接方式的片段,然后克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-NGFR中;PCR擴(kuò)增NGFR片段,克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-IRES-EGFP前面;逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-NGFR-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,分析EGFP的表達(dá)比例和平均熒光強(qiáng)度（MFI）,同時(shí)分析NGFR的表達(dá)。結(jié)果成功構(gòu)建4個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-NGFR-IRES-EGFP;在293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染4個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,24 h和48 h時(shí)EGFP的表達(dá)效率沒有明顯差異,但熒光強(qiáng)度卻有明顯不同,同時(shí)NGFR的表達(dá)沒有明顯不同,說明IRES與EGFP之間加入不同的核苷酸序列,會(huì)使EGFP的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)明顯差異。結(jié)論 EGFP的表達(dá)強(qiáng)度受IRES與EGFP之間序列的影響,不同強(qiáng)度EGFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以適用于不同的實(shí)驗(yàn)要求。 

【文章來源】：中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 2020,40(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁


本文編號(hào)：3130202