在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,必須嚴(yán)格控制蛋白質(zhì)的更新速率,因?yàn)楹芏嘈潞铣傻牡鞍踪|(zhì)會(huì)迅速降解,同時(shí),受損或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)也需要迅速降解,以保持細(xì)胞的新陳代謝。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是一種專門(mén)的蛋白質(zhì)水解系統(tǒng),可控制蛋白質(zhì)降解并在維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。其不僅在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面很重要,而且在與DNA損傷和修復(fù),細(xì)胞增殖和存活,細(xì)胞分化以及耐藥性有關(guān)的眾多細(xì)胞調(diào)節(jié)中具有重要生物學(xué)功能。C1orf109作為一個(gè)新的蛋白分子,其發(fā)揮的生物學(xué)功能以及潛在的分子調(diào)控機(jī)制目前仍不清楚。在前期的研究中發(fā)現(xiàn),C1orf109蛋白在多種腫瘤細(xì)胞中呈低表達(dá),但是其低表達(dá)的原因尚不明確。因此,本課題對(duì)C1orf109蛋白265個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)（C1orf109-265）和280個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)（C1orf109-280）的穩(wěn)定性及其發(fā)生降解的分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步探究。研究中利用放線菌酮處理He La和HEK-293T細(xì)胞來(lái)抑制蛋白質(zhì)的合成,檢測(cè)C1orf109-265和C1orf109-280蛋白的半衰期,發(fā)現(xiàn)C1orf109-265蛋白的半衰期要比C1orf109-280的半衰期長(zhǎng),C1orf109-265... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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HeLa細(xì)胞中C1orf109-265/280蛋白半衰期分析

哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文-30-3.2.2HEK-293T細(xì)胞中C1orf109蛋白半衰期檢測(cè)為了進(jìn)一步確認(rèn)C1orf109蛋白在不同細(xì)胞中的半衰期是否存在差異或是相似，我們又將pCMV-Flag-C1orf109-265和pCMV-Flag-C1orf109-280兩種表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中，同樣地，在轉(zhuǎn)染24h后，將細(xì)胞換液為含有100μg/mL放線菌酮的DMEM培養(yǎng)基，在加入放線菌酮處理0h，0.5h，1h，2h，3h和4h時(shí)，分別收取細(xì)胞，加入100μL裂解液提取總蛋白，以β-actin蛋白作為內(nèi)參，利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)C1orf109蛋白表達(dá)水平變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-2所示，從圖中可以看出，與在HeLa細(xì)胞中相似，C1orf109-265蛋白和C1orf109-280蛋白在加入放線菌酮處理后，蛋白表達(dá)量逐漸下降，在4h時(shí)，兩者表達(dá)量均接近于零，C1orf109-265蛋白的半衰期在2h-3h之間，C1orf109-280蛋白半衰期1h左右；對(duì)比來(lái)看，在HEK-293T細(xì)胞中，C1orf109-265蛋白比C1orf109-280蛋白半衰期長(zhǎng)，較為穩(wěn)定。圖3-2HEK-293T細(xì)胞中C1orf109-265/280的半衰期分析a)C1orf109-265蛋白半衰期檢測(cè)b)C1orf109-280蛋白半衰期檢測(cè)c)C1orf109-265/280蛋白半衰期檢測(cè)灰度分析圖

哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文-31-3.3C1orf109蛋白經(jīng)蛋白酶體途徑降解3.3.1C1orf109-265蛋白經(jīng)蛋白酶體途徑降解在了解C1orf109蛋白兩個(gè)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的半衰期基礎(chǔ)上，為了探究C1orf109-265蛋白在細(xì)胞內(nèi)的降解途徑，本研究使用MG132來(lái)處理細(xì)胞。MG132是一種常用的蛋白酶體抑制劑，可以抑制通過(guò)蛋白酶體途徑降解的蛋白質(zhì)發(fā)生降解。在六孔板HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染2μg的pCMV-Flag-C1orf109-265質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染6h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液；轉(zhuǎn)染24h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行MG132加藥處理，將MG132儲(chǔ)存液稀釋到DMEM培養(yǎng)基中，使其終濃度為10μM，使用含有MG132的DMEM培養(yǎng)基給細(xì)胞換液，繼續(xù)培養(yǎng)；在加入MG132處理0h，0.5h，1h，2h，3h和4h時(shí)，分別收取細(xì)胞，加入100μL裂解液提取總蛋白，以β-actin蛋白作為內(nèi)參，利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)C1orf109蛋白表達(dá)水平變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-3所示，從圖中可以看出，C1orf109-265蛋白在加入MG132處理后，蛋白表達(dá)量逐漸上升，在MG132作用4h后，C1orf109-265蛋白發(fā)生了明顯的積累，說(shuō)明C1orf109-265蛋白可以通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑發(fā)生降解。圖3-3HeLa細(xì)胞中不同MG-132作用時(shí)間對(duì)C1orf109-265蛋白水平影響a)C1orf109-265蛋白表達(dá)量檢測(cè)b)C1orf109-265蛋白表達(dá)量灰度分析圖為了探究C1orf109-265蛋白在不同細(xì)胞中的降解途徑，我們?cè)贖EK-293T細(xì)胞中進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析。如圖3-4所示，我們得到了相同的結(jié)果，在使用MG132處理細(xì)胞后，C1orf109-265蛋白表達(dá)水平逐漸上升，MG132作用4h后，C1orf109-265蛋白發(fā)生了明顯的積累，說(shuō)明C1orf109-265蛋白可以通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑發(fā)生降解。


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