發(fā)布時間：2021-04-03 04:28

　　在哺乳動物細胞中,必須嚴格控制蛋白質的更新速率,因為很多新合成的蛋白質會迅速降解,同時,受損或錯誤折疊的蛋白質也需要迅速降解,以保持細胞的新陳代謝。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是一種專門的蛋白質水解系統(tǒng),可控制蛋白質降解并在維持細胞內蛋白質穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。其不僅在調節(jié)蛋白質穩(wěn)態(tài)方面很重要,而且在與DNA損傷和修復,細胞增殖和存活,細胞分化以及耐藥性有關的眾多細胞調節(jié)中具有重要生物學功能。C1orf109作為一個新的蛋白分子,其發(fā)揮的生物學功能以及潛在的分子調控機制目前仍不清楚。在前期的研究中發(fā)現(xiàn),C1orf109蛋白在多種腫瘤細胞中呈低表達,但是其低表達的原因尚不明確。因此,本課題對C1orf109蛋白265個氨基酸蛋白質（C1orf109-265）和280個氨基酸蛋白質（C1orf109-280）的穩(wěn)定性及其發(fā)生降解的分子調控機制進行了初步探究。研究中利用放線菌酮處理He La和HEK-293T細胞來抑制蛋白質的合成,檢測C1orf109-265和C1orf109-280蛋白的半衰期,發(fā)現(xiàn)C1orf109-265蛋白的半衰期要比C1orf109-280的半衰期長,C1orf109-265... 

【文章來源】：哈爾濱工業(yè)大學黑龍江省 211工程院校 985工程院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

HeLa細胞中C1orf109-265/280蛋白半衰期分析

哈爾濱工業(yè)大學理學碩士學位論文-30-3.2.2HEK-293T細胞中C1orf109蛋白半衰期檢測為了進一步確認C1orf109蛋白在不同細胞中的半衰期是否存在差異或是相似，我們又將pCMV-Flag-C1orf109-265和pCMV-Flag-C1orf109-280兩種表達質粒瞬時轉染到HEK-293T細胞中，同樣地，在轉染24h后，將細胞換液為含有100μg/mL放線菌酮的DMEM培養(yǎng)基，在加入放線菌酮處理0h，0.5h，1h，2h，3h和4h時，分別收取細胞，加入100μL裂解液提取總蛋白，以β-actin蛋白作為內參，利用蛋白質免疫印跡技術檢測C1orf109蛋白表達水平變化。實驗結果如圖3-2所示，從圖中可以看出，與在HeLa細胞中相似，C1orf109-265蛋白和C1orf109-280蛋白在加入放線菌酮處理后，蛋白表達量逐漸下降，在4h時，兩者表達量均接近于零，C1orf109-265蛋白的半衰期在2h-3h之間，C1orf109-280蛋白半衰期1h左右；對比來看，在HEK-293T細胞中，C1orf109-265蛋白比C1orf109-280蛋白半衰期長，較為穩(wěn)定。圖3-2HEK-293T細胞中C1orf109-265/280的半衰期分析a)C1orf109-265蛋白半衰期檢測b)C1orf109-280蛋白半衰期檢測c)C1orf109-265/280蛋白半衰期檢測灰度分析圖

哈爾濱工業(yè)大學理學碩士學位論文-31-3.3C1orf109蛋白經蛋白酶體途徑降解3.3.1C1orf109-265蛋白經蛋白酶體途徑降解在了解C1orf109蛋白兩個蛋白質在細胞中的半衰期基礎上，為了探究C1orf109-265蛋白在細胞內的降解途徑，本研究使用MG132來處理細胞。MG132是一種常用的蛋白酶體抑制劑，可以抑制通過蛋白酶體途徑降解的蛋白質發(fā)生降解。在六孔板HeLa細胞中轉染2μg的pCMV-Flag-C1orf109-265質粒，轉染6h后對細胞進行換液；轉染24h后，對細胞進行MG132加藥處理，將MG132儲存液稀釋到DMEM培養(yǎng)基中，使其終濃度為10μM，使用含有MG132的DMEM培養(yǎng)基給細胞換液，繼續(xù)培養(yǎng)；在加入MG132處理0h，0.5h，1h，2h，3h和4h時，分別收取細胞，加入100μL裂解液提取總蛋白，以β-actin蛋白作為內參，利用蛋白質免疫印跡技術檢測C1orf109蛋白表達水平變化。實驗結果如圖3-3所示，從圖中可以看出，C1orf109-265蛋白在加入MG132處理后，蛋白表達量逐漸上升，在MG132作用4h后，C1orf109-265蛋白發(fā)生了明顯的積累，說明C1orf109-265蛋白可以通過泛素-蛋白酶體途徑發(fā)生降解。圖3-3HeLa細胞中不同MG-132作用時間對C1orf109-265蛋白水平影響a)C1orf109-265蛋白表達量檢測b)C1orf109-265蛋白表達量灰度分析圖為了探究C1orf109-265蛋白在不同細胞中的降解途徑，我們在HEK-293T細胞中進行了相同的實驗檢測分析。如圖3-4所示，我們得到了相同的結果，在使用MG132處理細胞后，C1orf109-265蛋白表達水平逐漸上升，MG132作用4h后，C1orf109-265蛋白發(fā)生了明顯的積累，說明C1orf109-265蛋白可以通過泛素-蛋白酶體途徑發(fā)生降解。


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