N⁶-甲基化腺嘌呤核苷酸（m⁶A）修飾是迄今為止在真核生物中發(fā)現(xiàn)最多的m RNA水平上的修飾,具有重要的生物學(xué)功能。N⁶-甲基化腺嘌呤核苷單磷酸（N⁶-m AMP）被認(rèn)為是含有m⁶A修飾的RNA代謝產(chǎn)生的中間產(chǎn)物,如果不及時(shí)周轉(zhuǎn),將會(huì)被RNA聚合酶II（Pol II）錯(cuò)誤地插入到新合成的RNA中。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中,脫氨酶ADAL（Adenosine Deaminase-Like）被證實(shí)可以促進(jìn)N⁶-m AMP的代謝,催化N⁶-m AMP反應(yīng)生成次黃嘌呤核苷單磷酸（IMP）以阻止N⁶-m AMP錯(cuò)誤地插入到新合成的RNA中。雖然該蛋白的功能被報(bào)道,但是ADAL蛋白的三維結(jié)構(gòu)還未被解析。在本論文中我們第一次運(yùn)用蛋白質(zhì)晶體學(xué)手段解析了AtADAL蛋白的晶體結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)該蛋白由中間的9個(gè)平行β-strand和外圍的15個(gè)-helices組成,屬于典型的TIM桶式結(jié)構(gòu)。在其活性位點(diǎn)中有一... 

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鑒定陽(yáng)性單克隆菌株結(jié)果

哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文-23-少量對(duì)應(yīng)菌株的菌液送生物公司測(cè)序，1天后收到測(cè)序結(jié)果，與已有基因序列比對(duì)均無(wú)誤。從中任意挑選一個(gè)菌株保存。2.3.2AtADAL蛋白純化蛋白質(zhì)序列分析發(fā)現(xiàn)其中含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，所以在第一次搖菌時(shí)向培養(yǎng)基中引入了鋅離子，其余實(shí)驗(yàn)步驟沒有變化。將引入鋅離子的菌液高壓機(jī)械破碎、離心后取上清液先用一個(gè)Ni-NTA純化樹脂預(yù)裝柱初步純化分離AtADAL蛋白，收集洗脫樣品跑SDSPAGE電泳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2-2所示。圖2-2引入鋅離子的菌液初步純化結(jié)果如圖2-2所示，在全菌液泳道中可以看到在目的蛋白大小處有蛋白條帶，在上清液泳道中在該處未見明顯的蛋白條帶，從Ni-NTA純化樹脂預(yù)裝柱上洗脫下的樣品中同樣也在該處看不到明顯的蛋白條帶，重復(fù)這個(gè)實(shí)驗(yàn)后得到同樣的結(jié)果。所以決定重新培養(yǎng)菌株時(shí)不引入鋅離子，重復(fù)相同的純化實(shí)驗(yàn)操作后實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2-3所示。如圖2-3所示，膠圖中在目的蛋白大小附近有清晰的蛋白條帶，蛋白表達(dá)量較大，洗脫樣品中還含有少量其他雜蛋白，且此時(shí)目的蛋白還帶有His6-SUMO純化上樣量：7μL

哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文-24-標(biāo)簽，要想得到符合晶體生長(zhǎng)要求的蛋白樣品，還需要進(jìn)一步從洗脫樣品中純化分離AtADAL蛋白。圖2-3未引入鋅離子后AtADAL蛋白初步純化結(jié)果Ni-NTA純化樹脂預(yù)裝柱上洗脫下的蛋白樣品經(jīng)Ulp1酶切透析后His6-SUMO純化標(biāo)簽與AtADAL蛋白分開，用兩個(gè)串聯(lián)的Ni-NTA純化樹脂預(yù)裝柱去除切掉的純化標(biāo)簽和未切開的蛋白，流出液樣品濃縮后經(jīng)分子篩純化，結(jié)果如圖2-4所示。按分子篩純化結(jié)果圖收集AtADAL蛋白樣品，跑SDSPAGE電泳檢測(cè)蛋白樣品的純度是否符合要求，結(jié)果如圖2-5所示。圖2-4AtADAL蛋白分子篩HiLoad16/600Superdex200-pgcolumn純化結(jié)果峰值在84.86ml處，流速為1ml/min。上樣量：7μL


本文編號(hào)：3099280