發(fā)布時(shí)間：2021-03-19 13:47

　　目的:以小鼠睪丸組織c DNA文庫為模板,利用RT-PCR技術(shù)成功地克隆出了一個(gè)在小鼠睪丸組織中特異性高表達(dá)的與生精細(xì)胞凋亡相關(guān)的新基因LRRC34。方法:經(jīng)生物信息學(xué)分析,該基因定位于小鼠3號(hào)染色體的3A和3B之間,并且含有11個(gè)外顯子,10個(gè)內(nèi)含子。其c DNA全長(zhǎng)序列為1 840 bp,開放閱讀框?yàn)? 248 bp,編碼一個(gè)含有415個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。結(jié)果:多組織RT-PCR結(jié)果表明,該基因僅在小鼠睪丸組織中特異性表達(dá),因此推測(cè)其可能在睪丸發(fā)育和精子形成的過程中起重要作用。結(jié)論:本基因的克隆為后續(xù)LRRC34基因功能的研究奠定了良好的基礎(chǔ),為男性生殖方面相關(guān)疾病提供了一定的理論依據(jù)。 

【文章來源】：生物化工. 2020,6(01)

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

RT-PCR檢測(cè)小鼠多組織cDNA第一鏈

通過改變退火溫度進(jìn)行最佳條件的探索，得到該基因的最佳退火溫度為62℃，在最佳PCR克隆條件下對(duì)LRRC34基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增（如圖2示）。從圖2中可看到，小鼠睪丸組織擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物，且基因片段長(zhǎng)度在1 000～2 000 bp之間，這與LRRC34基因預(yù)期片段長(zhǎng)度1 557 bp大體相符，說明該基因確實(shí)在小鼠睪丸組織中有表達(dá)，LRRC34基因被成功地?cái)U(kuò)增。將克隆產(chǎn)物連接到p MD18-T Vector Kit載體上，經(jīng)測(cè)序，結(jié)果與序列完全一致，說明拼接序列是正確的。然后將含有LRRC34基因T載體的E.coli Top10菌液培養(yǎng)，抽質(zhì)粒保存在超低溫冰箱用于做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.4 基因LRRC34在小鼠不同組織中的表達(dá)水平

以逆轉(zhuǎn)錄合成的小鼠多組織cDNA第一鏈為模板，用LRRC34的設(shè)計(jì)的引物作為引物，使用Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增LRRC34基因（如圖3示）。從圖3可看到，LRRC34基因僅在小鼠睪丸組織中有表達(dá)，而在小鼠其他組織中均不表達(dá)，從這一點(diǎn)說明LRRC34基因具有組織特異性，故而可以推斷LRRC34基因是睪丸特異表達(dá)基因。3 討論

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]男性不育基礎(chǔ)研究的現(xiàn)狀及可能性途徑[J]. 丁之德.  中國(guó)男科學(xué)雜志. 2010(03)
[2]小鼠生精細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的分子克隆[J]. 姜宏,李麓蕓,盧光琇.  生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào). 2001(04)
[3]小鼠雄性生殖細(xì)胞生后發(fā)育中的程序性死亡[J]. 王瑞安,小路武彥,鄭平菊,張遠(yuǎn)強(qiáng),中根一穗.  解剖學(xué)報(bào). 1998(04)

碩士論文
[1]睪丸特異表達(dá)新基因Spata34和Mage-k1的克隆及蛋白表達(dá)和分離純化[D]. 陳宏波.湖南理工學(xué)院 2017
[2]小鼠新基因Dnajc5b的克隆表達(dá)及Rcet1敲除后表型的檢測(cè)研究[D]. 徐帥.湖南理工學(xué)院 2017



本文編號(hào)：3089676