發(fā)布時間：2021-03-05 06:07

　　實(shí)時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR）是廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。在基因表達(dá)分析過程中,選擇穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性非常重要。以低溫誘導(dǎo)24 h和72 h蒙古韭（Allium mongolicum）的葉片為材料,無處理0 h葉片為對照,使用熒光定量PCR法分析了Am5S-rRNA、AmActin、AmGAPDH和AmEF1-α4個看家基因的表達(dá)情況。通過ge Norm和NormFinder程序分析,發(fā)現(xiàn)AmGAPDH穩(wěn)定性最好,Am5S-r RNA和AmActin次之,AmEF1-α穩(wěn)定性最差,因此選擇AmGAPDH作為蒙古韭基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因。本研究通過qRT-PCR方法分析穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因,對后續(xù)蒙古韭低溫誘導(dǎo)基因表達(dá)分析有重要的意義。 

【文章來源】：基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2020,39(01)北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

蒙古韭葉片總RNA的電泳

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)成為基因表達(dá)分析研究常規(guī)技術(shù)之一(Huggett et al.,2005)。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中，由于RNA得率和濃度高低、反轉(zhuǎn)錄效率不同以及其他人為因素等導(dǎo)致目的基因表達(dá)分析結(jié)果出現(xiàn)偏差(Dorak,2006)，因此需要利用內(nèi)參基因進(jìn)行校正，從而產(chǎn)生相對準(zhǔn)確的結(jié)果，縮小偏差(Nolan et al.,2006)。理論上來說，內(nèi)參基因在植物發(fā)育的任何時期和任何部位都能穩(wěn)定地表達(dá)，但實(shí)際上沒有一種內(nèi)參基因是始終穩(wěn)定表達(dá)的，由于不同的實(shí)驗(yàn)條件、不同的研究材料、不同的處理?xiàng)l件下，理想的內(nèi)參基因是不同的(Volkov et al.,2003)。因此我們在研究一種新的植物材料基因表達(dá)分析時，選擇合適的穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因至關(guān)重要。圖3 利用GeNorm程序分析各內(nèi)標(biāo)基因的表達(dá)穩(wěn)定值(M)

圖2 利用定量PCR引物擴(kuò)增目標(biāo)基因?qū)τ诓煌难芯坎牧�，以及相同研究材料不同研究�?nèi)容，所選擇的最適內(nèi)參基因是不同的，找出合適的內(nèi)參基因?qū)τ诨虮磉_(dá)分析的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。而不能簡單地通過總RNA的定量來分析基因的表達(dá)情況，因?yàn)榭俁NA定量容易受到殘留DNA的污染，導(dǎo)致基因表達(dá)分析偏差較大。但是可以借助總RNA定量的方法為進(jìn)行定量PCR的總RNA的反轉(zhuǎn)錄提供參考，使樣品間的差異不會太大，使后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄和PCR過程中盡可能減小誤差，盡可能地準(zhǔn)確反映內(nèi)參基因的相對表達(dá)量(張艷君等,2007)。

【參考文獻(xiàn)】：
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