植物RNA病毒載體表達(dá)系統(tǒng)是一種有潛力的外源基因瞬時(shí)表達(dá)平臺,生物安全性是阻礙其應(yīng)用的瓶頸問題之一。Ⅰ型啟動子具有的種屬間特異性,理論上可以縮小重組病毒的宿主范圍降低病毒載體潛在的生物危害性。Ⅰ型啟動子已被廣泛應(yīng)用于動物病毒載體的研究中,但在植物中卻鮮有報(bào)道。植物Ⅰ型啟動子能否像哺乳動物Ⅰ型啟動子一樣,高效地提高病毒載體的生物安全性仍有待驗(yàn)證。鑒于此,本論文以番茄叢矮病毒（Tomato bushy stunt virus,TBSV）為實(shí)驗(yàn)材料,構(gòu)建本氏煙Ⅰ型啟動子介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的TBSV病毒表達(dá)載體,通過分析接種葉片中重組GFP表達(dá)情況,探索本氏煙Ⅰ型啟動子順式調(diào)控序列、轉(zhuǎn)錄特性和Ⅰ型終止子對病毒載體的影響,初步明確Ⅰ型啟動子介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的植物病毒載體表達(dá)系統(tǒng)的有效性和主要特征。研究發(fā)現(xiàn),①本氏煙Ⅰ型啟動子長度對啟動子轉(zhuǎn)錄頻率和病毒載體的表達(dá)水平無顯著影響;長度僅為77 nt的啟動子就可以起始病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄;并且其啟動子結(jié)構(gòu)中不存在類似于動物Ⅰ型啟動子的上游控制元件（Upstream control element,UCE）;②啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游T串序列以及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)核苷酸A/G互... 

【文章來源】：寧夏大學(xué)寧夏回族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：48 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖３－５內(nèi)含子病毒表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)??ＲＢ：Ｉ－ＤＮＡ右邊界：Ｐｏｌｌｌ－３５Ｓ：花揶菜花葉病毒３５Ｓ啟動子：ｐ３３，ｐ９２，ｐｌ９和ｐ２２：?ＩＢＳＶ病毒基因組編碼區(qū)，??

：：：ｉｉｔｔｉｙｙｉｉｉｉｉｉ??Ｂ．?２５．０—?■參？－？■魯??圖３－６重組ＧＦＰ在煙草葉片中的表達(dá)情況??Ａ．不同處理在煙草葉片上的接種位置；Ｂ．長波紫外光下接種葉片的表型；Ｃ．重組ＧＦＰ的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ??Ｂｌｏｔｓ檢測；Ｍ：?Ｐｒｏｔｅｉｎ?Ｍａｒｋｅｒ：?Ｈ：健康樣品；Ｓ：?ＧＦＰ標(biāo)準(zhǔn)樣品；ｄｐｉ：接種后天數(shù)??ＥＬＩＳＡ定量分析結(jié)果顯示，Ｐｏｌ?ＩＩ－Ｇ、Ｐｏｌ?ＩＩ－Ｇ－９ｉｎｔｒ和Ｅ２Ｍ）Ｐｏｌ?Ｉ－Ｇ病毒載體在重組ＧＦＰ的表??達(dá)量上無顯著差異（ｐ＞０．０５），進(jìn)一步證實(shí)修改后的Ｉ型啟動子與ＩＩ型啟動子具有相似的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)??度（圖３－７Ａ）。此外，Ｅ２Ｍ？ＰｏｌＩ－Ｇ－９ｉｍｒ載體依然能夠低水平地表達(dá)報(bào)告基因ＧＦＰ，其表達(dá)產(chǎn)物??含量為無內(nèi)含子Ｉ型啟動子病毒表達(dá)載體的１／１２？１／１５?（圖３－７Ｂ）。??Ａ．?Ｂ．??２５００－?ｎｓ?｜?＂Ｐｏ１?＂＇Ｇ?１６－｜?■?Ｐｏｌ?ｎ－Ｃ?■?Ｅ２ＮｂＰｏｌ?Ｉ－Ｇ??！?２＿］?ｎｎ?｜Ｈ?．ｐ０ｌＩ，．Ｇ－９ｉ？ｌｒ?

在接種后第４天提取每個(gè)處理樣品的總ＲＷＡ，并通過體外反轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的ｃＤＮＡ。以含有??內(nèi)含子和無內(nèi)含子的質(zhì)粒為對照進(jìn)行ＰＣＲ反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳檢測，在核酸水平上分析內(nèi)含??子序列在煙草植物細(xì)胞核內(nèi)的加工過程。檢測引物位置及檢測的內(nèi)含子位置如圖３－８Ａ所示。從??檢測結(jié)果來看（圖３－８Ｂ）?，?４種載體的擴(kuò)增條帶與無內(nèi)含子質(zhì)粒對照ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小一??致，而內(nèi)含子質(zhì)粒對照樣品ＰＣＲ產(chǎn)物擴(kuò)增條帶略大。由于４種病毒表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中均為??未檢測到內(nèi)含子序列，推測１型啟動子內(nèi)含子載體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能夠被宿主細(xì)胞內(nèi)含子加工機(jī)器識??別并加工。由于１型和Ｕ型啟動子都具有ＴＡＴＡ框，推測受體植物細(xì)胞中的Ｐｏｌ?１１識別了?１型啟??動子并發(fā)生了低水平轉(zhuǎn)錄，植物ｉ型啟動子具有轉(zhuǎn)錄的非專一性特點(diǎn)。??Ａ．??５’?ＵＴＲ?ｐ３３?ｐ９２??＾?ＩＩ?ＩＩ?ＩＩ?Ｉ?ＩＩ?ＩＩ?ＩＩ?ＩＩ?ＩＩ?１１?１??—？?－４—??Ｉ??ｔ?５?１??．Ｉ?１?％??ｉ?ｒｉ?＾?％?％??Ｂ．?ｃ?＾１２?｜｜??ｅ?＝窆?Ｉ?｜?｜??Ｍ?￡?￡?Ｓ?Ｓ?￡?ｉ??２０００—?Ｉ??圖３－８病毒載體中內(nèi)含子在寄主細(xì)胞核中的加工情況分析（４?ｄｐｉ）??Ａ．?ｐ３３和ｐ９２編碼區(qū)中內(nèi)含子位置示意圖及其ＲＴ－ＰＣＲ檢測引物位置示意圖；箭頭顯示引物對位置和方向：??Ｂ．?ＲＴ－ＰＣＲ檢測ｐ３３和ｐ９２編碼區(qū)中內(nèi)含子在寄主細(xì)胞中的加工情況??３．２．２?ＥＬＳ和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游序列對Ｉ型啟動子轉(zhuǎn)錄專一性影響??為了探究植物１型啟動子轉(zhuǎn)錄的非專一性是由于下游延仲序列和ＥＬＳ序列的修改造成的

【參考文獻(xiàn)】：
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：3034638