大部分細(xì)菌和幾乎所有古生菌的基因組中,都存在著一種規(guī)律排列成簇的短回文重復(fù)序列CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）,由 spacer和repeat間隔排列組成。這種重復(fù)序列的相鄰位置往往是一些CRISPR相關(guān)蛋白（CRISPR-associated proteins）Cas的編碼基因,這類蛋白具有核糖核酸內(nèi)切酶的功能,與CRISPR轉(zhuǎn)錄出的導(dǎo)向性RNA共同形成這些微生物中的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng),即CRISPR-Cas系統(tǒng),用于抵御外來病毒和噬菌體的入侵。基于該系統(tǒng)的特性,人們發(fā)展了一系列高效的基因編輯工具,在植物、動(dòng)物、微生物中均得到廣泛應(yīng)用。Cas12a（又稱Cpf1）屬于Cas蛋白家族的ClassII typeV型蛋白,含有Ruvc結(jié)構(gòu)域和Nuc結(jié)構(gòu)域,同時(shí)具備DNA核酸酶活性和RNA核酸酶活性。與常用的Cas9不同的是,Cas12a不僅可以對(duì)靶標(biāo)DNA進(jìn)行切割,也可以對(duì)自身CRISPR轉(zhuǎn)錄的RNA前體進(jìn)行切割加工,形成成熟的crRNA（CRISPRRNA）。而且Cas12a蛋白的分子量比C... 

【文章來源】：河南大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－１．四種不同來源的Ｃａｓｌ２ａ蛋白對(duì)揚(yáng)氏梭菌的體內(nèi)毒性測(cè)試??注：對(duì)照為不攜帶Ｃａｓｌ２ａ蛋白的質(zhì)粒；Ｆｎ：新兇手弗朗西斯菌議：加／／＾／?ｓｕｂｓｐ．?／７〇ｖ／ｃ油??

?１??Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｆｎ?Ｂｂ?Ｈｋ?Ｔｓ??圖２－１．四種不同來源的Ｃａｓｌ２ａ蛋白對(duì)揚(yáng)氏梭菌的體內(nèi)毒性測(cè)試??注：對(duì)照為不攜帶Ｃａｓｌ２ａ蛋白的質(zhì)粒；Ｆｎ：新兇手弗朗西斯菌議：加／／＾／?ｓｕｂｓｐ．?／７〇ｖ／ｃ油??Ｕ１１２）；??Ｂｂ：擬桿菌（召沉妙ＫＡ００２５１）?；?Ｈｋ：創(chuàng)傷球菌ｆｅｍｚ＂?ＡＴＣＣ?５１３６６）；??Ｔｓ：硫微螺菌（７７？／讀／ｒａ?ｓｐ．?ＸＳ５）??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１．?Ｉｎ?ｖｉｖｏ?ｔｏｘｉｃｉｔｙ?ｔｅｓｔ?ｏｆ?ｆｏｕｒ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｓｏｕｒｃｅｓ?ｏｆ?Ｃａｓｌ２ａ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ａｇａｉｎｓｔ?Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ??ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ．?Ｔｈｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｉｓ?ａ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｔｈａｔ?ｄｏｅｓ?ｎｏｔ?ｃａｒｒｙ?ｔｈｅ?Ｃａｓｌ２ａ?ｐｒｏｔｅｉｎ；??Ｆｎ：?Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ?ｎｏｖｉｃｉｄａ?ｓｕｂｓｐ．?ｎｏｖｉｃｉｄａ?Ｕ１１２；?Ｂｂ：?Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ?ｂａｃｔｅｒｉｕｍ?ＫＡ００２５１；?Ｈｋ：??Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ?ｋｕｎｚｉｉ?ＡＴＣＣ?５１３６６）；?Ｔｓ：?Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ?ｓｐ．?ＸＳ５??７０００?ｎ?□?Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｈ?Ｐ０２４４０?ＤＰａｒａＥ??…＾?ＩＨＰ０９１１０?Ｃ］Ｐ４１６７０?ＣＩＰ３９３４０?＿??６０００?＇?－Ｐ０１４４０??ｒａ?５０００?－?１５。］??３?４０００?－?１００??ｆ?３０００?－５０＇?■?Ｉ?＾?ｒｌ??１?２０００?產(chǎn)?１??ｉ〇〇〇?－?ｒ?■??〇?Ｊ?ｒ－ｎ?■?

ｐＺＧＦｎｃａｓ?１２ａ－ｐｔａＯ?Ｉ?（構(gòu)建方法見本章材料與方法）。質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入揚(yáng)氏梭菌感受??態(tài)細(xì)胞。結(jié)果表明，導(dǎo)入這兩個(gè)質(zhì)粒的揚(yáng)氏梭菌在平板培養(yǎng)基上均沒有產(chǎn)生任何轉(zhuǎn)化子，??而對(duì)照質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子數(shù)量較多（圖２－３）。這就暗示Ｆ？Ｃａｓ１２ａ蛋白在揚(yáng)氏梭菌中具有較??高的切割雙鏈ＤＮＡ的活性，可以作為建立基因編輯工具的功能蛋白。??Ｐ０１４４０?Ｐｔｈｌ??—＾Ｆ＾Ｃａｓ１２ａ＾＾＾?ｃｒＲＮＡＳ－??３６０?１????５?３００?：??￥?２４０?；??蘭１８０?；??ＺＬ??ｇ１２０；??°?６０?：??０??Ｉ?ｉ?１???＃?＞?＾??ｃ／?４?ｃ／??圖２－３．?Ｆ／ＣａｓＰａ－ｃｒＫＮＡ復(fù)合物的構(gòu)建及其在Ｃ．．／ＷＡ７職Ｗ；／／／中切割雙鏈ＤＮＡ的效率測(cè)試。??注：靶標(biāo)基因?ＣＵＵ＿ｃ３５６８０，?靶標(biāo)基因?ＣＬＲＪ＿ｃｌ２７７０。Ｃｏｎｔｒｏｌ：攜帶?Ｆ？Ｃａｓｌ２ａ?但不含??ｃｒＲＮＡ的質(zhì)粒。??Ｆｉｇｕｒｅ?２－３．?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｒ＾ＣａｓｌＺａ－ｃｒＲＮＡ?ｃａｓｓｅｔｔｅ?ａｎｄ?ｉｔｓ?ｃｌｅａｖａｇｅ?ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ?ｏｆｄｏｕｂｌｅ??ｓｔｒａｎｄ?ＤＮＡ?ｉｎ?Ｃ．?Ｉｊｉｍｇｄａｈｌｉｉ．?Ｔｈｅ?ｔａｒｇｅｔｓ?ｃｈｏｓｅｎ?ｆｏｒ?ｔｅｓｔ?ａｒｅ?ｔｈｅｐｙｒＥ?ａｎｄ?ｐｔａ?ｇｅｎｅ．?Ｃｏｎｔｒｏｌ：??ｔｈｅ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｃａｒｒｙｉｎｇ?Ｆ？Ｃａｓｌ２ａ?ｂｕｔ?ｎｏ?ｃｒＲＮＡ．??２．３．３構(gòu)建ＣＦＵＳＰＲ－Ｃａｓｌ２ａ基因敲除質(zhì)粒??基于上述結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]新一代基因組編輯系統(tǒng)CRISPR/Cpf1[J]. 楊帆,李寅.  生物工程學(xué)報(bào). 2017(03)



本文編號(hào)：2937670