在植物的基因組進行定點編輯對農作物的遺傳改良具有重要意義。目前,CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其簡便性和高效性已被廣泛應用于包含馬鈴薯在內的多種作物的基因組編輯。然而,由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅能識別PAM序列為5’-NGG-3’的前導序列,極大限制了其定點編輯的適用范圍,因此如何擴展CRISPR系統(tǒng)的編輯范圍是目前基因編輯領域一個重要的研究方向。CRISPR/Cpf1是一類新型CRISPR系統(tǒng),其可特異識別PAM序列為5’-TTTN-3’后面的24 bp,這極大豐富了CRISPR系統(tǒng)對靶標位點的選擇范圍,因而其也成為繼CRISPR/Cas9系統(tǒng)后又一研究熱點。然而CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在茄科作物中的研究還不是很深入,在馬鈴薯中的應用就未見報道,因此本論文擬針對CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在馬鈴薯中的應用進行系統(tǒng)的研究。首先,本論文根據(jù)前人的研究基礎,分別對Cpf1蛋白的兩個變體LbCpf1和AsCpf1進行了基于雙子葉植物的密碼子優(yōu)化,然后針對CrRNA的表達系統(tǒng),構建了4套優(yōu)化表達體系:核酸酶介導的RIBO系統(tǒng),基于Cys4的CrRNA切除的Csy4系統(tǒng),多順反子RNA表達的... 

【文章來源】：云南師范大學云南省

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

a圖為AsCpf1的晶體結構圖

圖 2.2 CIP-65 材料基因組的全長以及靶點示意圖在靶點的一個 5'端添加上 ATTG,在其反向互補的 5'端加上 AAAC。B位點合成引物，2 個靶點的設計了 4 條 sgRNA 的引物：StCDF1 sp1-F：ATTGGATTCATGATCCAAATGAAGStCDF1 sp1-R：AAACCTTCATTTGGATCATGAATCStCDF1 sp2-F：AGCGATGACATCAAGATGCStCDF1 sp2-R: GCATCTTGATGTCATCGCT將兩個引物做退火體系如表(2.3)sgRNA引物退火體系表 2.3成分 加入量tCDF1 sp1/sp2-F (100 μM） 3μLStCDF1 sp1/sp2-R (100 μM) 3μL10xNEB buffer3.1 10μL超純水 88 μLtotal 100 μL

第二章 載體的設計與構建酶切連接體系放在 PCR 儀中：37℃條件下 10 h；50℃條件下 5 m 10 min。取 10 μL 連接產物對大腸桿菌進行轉化后，經過菌篩后StCDF1/PKSE402 -SP1 載體與 StCDF1/PKSE402 –SP2。2.3 CRISPR/AS-Cpf1 與 CRISPR/LB-Cpf1 的載體組裝 CPF1 蛋白與其他載體元件大片段的合成 們 將 Acidaminococcus sp. BV3L6Cpf1(AsCpf1) 與 Lachnosum ND2006(LbCpf1)的 Cpf1 序列做了植物性密碼子優(yōu)化，并在公的合成：示意圖如下：2.3 與 2.4


本文編號：2911965